光甘草定羟丙基-β-环糊精包合物的制备及其对透皮吸收的影响研究

叶柳青，王　艳，韩宛盈，周晓霞，马宗武，崔广智

（天津中医药大学中药学院，天津300193）

光甘草定羟丙基-β-环糊精包合物的制备及其对透皮吸收的影响研究

叶柳青，王艳，韩宛盈，周晓霞，马宗武，崔广智

（天津中医药大学中药学院，天津300193）

［目的］优化光甘草定（GLA）羟丙基-β-环糊精包合物（HP-β-CD）的制备工艺，并考察其对体外透皮吸收的影响。［方法］采用正交实验，考察物料比、包合温度、包合时间对GLA包合率的影响。包合率为指标筛选最佳制备工艺。用Franz扩散池进行透皮吸收实验，研究HP-β-CD对GLA透皮吸收的影响。［结果］HP-β-CD包合GLA的优化工艺是质量倍数为15倍的HP-β-CD，40℃下包合1.5 h。光甘草定HP-β-CD包合物累积透过量高于光甘草定单体组。［结论］HP-β-CD能促进光甘草定的经皮渗透。

光甘草定；羟丙-β-环糊精；透皮吸收

光甘草定（GLA）为疏水性异黄酮类化合物，是光果甘草（Glycyrrhiza glabral）中的特有成分［1］，具有广泛的生物活性，如预防动脉粥样硬化［2］，抗炎［3］，抗骨质疏松［4］，神经保护作用［5］等。值得注意的是GLA可以抑制酪氨酸酶活性，阻碍皮肤的黑色素生成［3］，在化妆品领域被称为“美白黄金”。但是GLA几乎不溶于水，这就限制了其在外用制剂中的应用。药物经环糊精包合后，再经离体透皮吸收，药物的累积透过量明显增加［4］，其中羟丙基-β-环糊精包合物（HP-β-CD）能够提高难溶物质的溶解度，同时有利于提高包合物的稳定性［6-7］。

本研究以HP-β-CD作为包合材料，制备GLA的HP-β-CD包合物（GLA-HP-β-CD），并考察HP-β-CD对GLA透皮吸收的影响。

1　仪器与试剂

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津），FA 1004型万分之一分析天平（上海精科天平），TBP6型改良Franz透皮扩散实验仪（上海谐凯），84-II型磁力恒温搅拌器（山东甄城永兴），KQ-300 B型超声波清洗器（昆山超声仪器），LGJ-12型冷冻干燥机（北京松源华兴）。

GLA对照品（纯度＞98%，中国药品生物制品鉴定所），HP-β-CD（山东滨州智源生物），色谱纯乙腈和甲醇（天津康科德），分析纯乙醇、冰乙酸和氯化钠（天津康科德），生理盐水（实验室自制），甘油、硬脂酸和单硬脂酸甘油酯（天津光复精细化工），昆明种实验小鼠［（20±3）g，北京华阜康］。

2　方法

2.1GLA含量测定方法的建立

2.1.1色谱条件色谱柱：Hypersil ODS（4.6 mm× 200 mm，5 μm），流动相：乙腈-水-冰乙酸（55∶44∶1），流速：1mL/min，检测波长：280 nm，进样量固定为10 μL，柱温：25℃［8］。

2.1.2对照品溶液制备称取GLA对照品适量，以甲醇溶解，制得浓度为91.2 μg/mL的对照品储备液。

2.1.3线性关系考察将对照品储备液稀释，得到一系列GLA溶液，按2.1.1项下进行色谱分析，高相液相色谱法（HPLC）图谱见图1，以进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），在0.912～9.12 mg/L进行线性回归，得到回归方程=142 651.024 7X+ 25 286，r=0.999 4。

2.1.4精密度实验取同一对照品溶液，按2.1.1项下进行色谱分析，连续6次，吸取同一对照品溶液，按2.1.1项下进行色谱分析，连续6 d，记录峰面积积分值，GLA质量浓度的RSD分别为0.54%和0.28%，表明GLA的日内和日间精密度均良好。

2.1.5重复性实验取同一接收池中的GLA软膏接受液6份，按2.1.1项下进行色谱分析，计算得其质量浓度的RSD为0.82%，表明该方法重复性良好。

2.1.6稳定性实验吸取上述同一对照品溶液，分别在0、1、2、4、6、8、10、12 h按2.1.1项下进行色谱分析，计算得其质量浓度的RSD%为0.40%，表明GLA在12 h内稳定。

2.2GLA-HP-β-CD及其软膏的制备

2.2.1GLA-HP-β-CD的制备以投料量比、包合温度、包合时间为因素，包合率作为评价指标，正交因素水平。见表1。

表1　因素水平表Tab.1 Factors and levels orthogonal table

按照上述因素水平表中投料比称取相应质量的HP-β-CD和GLA，HP-β-CD加入适量蒸馏水中，按设置规定温度及转速磁力搅拌器，搅拌至溶解。GLA用少量无水乙醇溶解，逐滴加入HP-β-CD溶液中，继续搅拌至规定时间得到包合物。将不同条件下制得的GLA-HP-β-CD置于冰箱中冷藏1 h，抽滤，滤液放入冰箱中冷藏24 h，真空冷冻干燥得发黄蓬松块状物，即得GLA-HP-β-CD［9-10］。

2.2.2GLA-HP-B-CD软膏的制备按照如下表2中处方分别制备空白软膏，GLA软膏和GLA-HP-β-CD软膏。

表2　不同GLA软膏处方表Tab.2 Different prescription of glabridin ointments table

2.3GLA-HP-β-CD软膏对经皮吸收的影响

2.3.1离体鼠皮的制备取质量（20±2）g的昆明种小鼠，脱去其腹部被毛，剪下腹部皮肤，除去粘连的脂肪组织，以生理盐水为储存液置于4℃的冰箱中保存备用［11］，临用时吸干皮肤表面水分。

图1　GLA对照品溶液（A）、GLA-HP-β-CD（B）、空白软膏透皮吸收液（C）、GLA-HP-β-CD软膏透皮接受液（D）的HPLC图Fig.1HPLC chromatograms of glabridin reference substances solution（A），glabridin HP-β-CD solution（B），blank ointment sample solution（C），transdermal solution after application of glabridin HP-β-CD（D）

2.3.2实验方法处理好的鼠皮角质层向上固定于Franz扩散池上，接收池中加入30%的乙醇-生理盐水溶液7.5 mL，使鼠皮内层完全与接受液接触，打开透皮仪并设定恒温37℃，保持恒定转速200 r/min［12］。平衡1 h，排尽接收池内的气泡后给药。扩散池供给鼠皮面积上均匀涂上0.1 gGLA软膏，每组平行3次，分别在1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h时吸取接收液1 mL，每次取样后均补入相同体积的接收液［13］，按2.1.1方法进样分析。

3　实验结果与分析

3.1GLA的HPLC色谱结果GLA含量测定HPLC色谱图，见图1。

3.2GLA包合物含量测定精密称取GLA-HP-BCD置于5 mL量瓶内，用甲醇定容，超声30 min，按照上述色谱条件，HPLC法测定峰面积，每个样品测定3次，取平均值，带入公式［14］。

GLA-HP-B-CD含量测定结果见表3，方差分析见表4。

表3　正交实验结果Tab.3Results of orthogonal test

表4　包合率方差分析Tab.4Analysis of variance for inclusion efficiency

由表3可知，各因素影响包合率的顺序为A＞C＞B。由表4可知，投料质量比对包合率有显著影响［15］。综合以上数据得出最佳包合工艺为A1B1C1，即包合条件为GLA和HP-β-CD投料质量比为1∶15，包合温度为40℃，包合时间为1.5 h。

3.3验证实验按照上述最佳工艺条件，平行3组实验，得到的包合率分别为73.42%、73.44%、73.41%，平均包合率为73.42%，与正交实验得出的最佳工艺条件基本一致。见表5。

表5　验证实验结果Tab.5Results of verification experiments

3.4GLA及其包合物经皮给药实验结果

3.4.1数据计算方法取“2.3.2”项所取样品，按2.1.1方法进样分析，测定GLA的含量，根据下列公式计算GLA的累积透过量（Qn，μg/cm2）［16］。

Qn=（CnV+ΣCiVi）/A

Cn：第n个时间点吸取液的浓度mg/L

Ci：第n-i个时间点吸取液的浓度mg/L

V：接收液的总体积即7.5 mL

Vi：每次吸取的液体体积即1 mL

A：接收池的体积即1 cm2

3.4.2透皮吸收结果考察了GLA及GLA-HP-β-CD的透皮吸收效果，按2.2.2的方法制备GLA软膏及GLA-HP-β-CD软膏，按2.3.2方法进行透皮吸收实验，按2.1.1方法测定GLA含量，并计算GLA累积透过量。GLA及GLA-HP-β-CD的透皮吸收结果，以取样时间t为横坐标，以GLA累积透过量Qn为纵坐标作图。见图2。

图2　GLA及GLA-HP-β-CD软膏累积透过量曲线Fig.2Profile of accumulative permeation amount of glabridin and glabridin HP-β-CD

由图2可以看出，GLA-HP-β-CD的累积透过量大于GLA软膏的累积透过量，两者经t检验，有显著性差异（P＜0.05）。结果表明HP-β-CD能够促进GLA的透皮吸收，有利于GLA在制剂中的应用。

4　讨论

GLA为疏水性异黄酮类化合物，应用到化妆品中存在的一个难题是在皮肤中的渗透量很小，从而在实际应用中影响其美白祛斑效果。本文的目的是采用HP-β-CD包合GLA，以增加GLA的水溶性，并考察包合后的GLA在体外经皮吸收的渗透量。实验采用直接搅拌法制备GLA环糊精包合物，此方法制备过程简便，易操作，耗费时间短［17］。以包合率为检测指标，测定GLA-HP-β-CD的含量，优化得到最佳包合工艺即投料比为GLA∶HP-β-CD=1∶15（质量比），包合温度为40℃，包合时间为1.5 h。将GLA-HP-β-CD制备成软膏后，通过经皮给药实验结果表明，HP-β-CD能够促进GLA的透皮吸收，其原因可能与增大GLA的溶解度和稳定性有关［18］，下一步将对原因进一步探讨。

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（本文编辑：高杉，滕晓东）

Study on preparation of glabridin hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion compound and its effect of transdermal absoption

YE Liu-qing，WANG Yan，HAN Wan-ying，ZHOU Xiao-xia，MA Zong-wu，GUI Guang-zhi
（School of Chinese Materia Medica，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To optimize the preparation technology of glabridin hydroxypropyl-β-cyclodextrin（HP-β-CD）inclusion compound and investigate its effect of transdermal absoption.［Methods］With inclusion efficiency as the indice，the optimum preparation condition was studied by orthogonal test.Franz vertical diffusion cell was adopted to investigate transdermal performance of glabridin HP-β-CD.［Results］The optimal inclusion conditions were as follows：the ratio of glabridin to HP-β-CD was 1∶15（m/m），inclusion temperature was 40℃，inclusion time was 1.5 h.The cumulative permeation of glabridin HP-β-CD was higher than glabridin group.［Conclusion］HP-β-CD have significant effect on transdermal of glabridin.

glabridin；HP-β-CD；transdermal absoption

R285

A

1672-1519（2015）10-0622-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.11

西青区科技型中小企业发展专项资金项目（XQKH2013-011）；天津中医药大学第四届大学生科技创新基金项目（CXJJ2013ALL）。

叶柳青（1989-），女，硕士研究生，研究方向为中药药剂。

王艳，E-mail：paozhijiaoxue@126.com。

（2015-05-14）