知母药材的HPLC/PDA/ELSD指纹图谱研究*

魏静娜，刘征辉，赵琳琳，郭永泽，程　奕，温春秀

（1.天津海世达检测技术有限公司，天津300381；2.天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津300381；3.河北省农林科学院经济作物研究所，石家庄050051）

·中药研究·

知母药材的HPLC/PDA/ELSD指纹图谱研究*

魏静娜1，刘征辉1，赵琳琳1，郭永泽2，程奕2，温春秀3

（1.天津海世达检测技术有限公司，天津300381；2.天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津300381；3.河北省农林科学院经济作物研究所，石家庄050051）

［目的］建立知母药材的高效液相色谱仪-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用（HPLC/PDA/ELSD）指纹图谱。［方法］采用Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱，流动相为乙腈-0.1%冰醋酸，梯度洗脱流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长258 nm，ELSD检测器载气气压30 Psi，漂移管温度80℃。［结果］建立了知母的HPLC/PDA/ELSD指纹图谱，在HPLC-PDA色谱图中标定了17个共有峰，HPLC-ELSD色谱图中标定了14个共有峰。［结论］该方法重复性好，可用于知母药材的全面质量控制。

知母；指纹图谱；HPLC/PDA/ELSD

知母为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根茎，主产于河北、山西及山东等地。春、秋两季采挖，除去须根及泥沙，晒干，或除去外皮，晒干。切片入药，生用，或盐水炙用。现代药理研究表明，知母具有抗炎［1-4］、降血糖［5-8］、抗阿尔茨海默病［9-12］等作用，临床应用安全可靠，毒副作用小［13］。在知母药材的全面质量控制方面，目前文献报道的，多为采用紫外检测器或者蒸发光散射检测器得到的一维图谱［14-15］，文章采用二级管阵列/蒸发光散射（PDA/ELSD）两种检测器串联的方式，对河北省不同栽培区域的知母药材指纹图谱进行研究，得到了更加全面的知母药材质量控制方案。

1　仪器与材料

Waters 2695高效液相色谱仪（配有Waters2996 PDA检测器，Waters2424 ELSD检测器，Empower2色谱工作站），分析天平（METTLERXS205，METTLER AB54），Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。

芒果苷（111607-200402，购自中国药品生物制品检定所），新芒果苷（X-032-140602，纯度≥98%，购自成都瑞芬思科技有限公司），知母皂苷BII（111839-201102，纯度90.8%，购自中国药品生物制品检定所），乙腈（色谱纯，Merck公司），冰乙酸（色谱纯，天津康科德科技有限公司），乙醇（分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司）。

知母药材来源见表1，经河北省农林科学院经济作物研究所温春秀研究员鉴定为百合科植物知母。

表1　知母药材来源Tab.1Origins of Rhizoma Anemarrhenae

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流动相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脱：0～10 min，5%～18%A；10～15 min，18%～25%A；15～25 min，25%A；25～50 min，25%～100%A；50～55 min，100%A；55～60 min，100%～5%A；60～75 min，5%A；流速：1.0 mL/min。PDA检测器检测波长：258 nm，ELSD检测器：氮气压力30Psi，漂移管温度80℃，进样体积：20μL。

2.2对照品溶液的制备精密称取新芒果苷，芒果苷，知母皂苷BII，加70%乙醇，制成每mL含0.10 mg的混合标准溶液。

2.3供试品溶液的制备取干燥的知母药材粉末（过60目筛）0.5 g，精密称定，置于50 mL的具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，冷却，用70%的乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。

2.4方法学考察

2.4.1稳定性实验取1号知母药材粉末，精密称定，按照“2.3”项下的方法，制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24、36、48 h检测指纹图谱。主要共有峰保留时间及峰面积比值的RSD值分别为0.05%～0.031%，0.06%～0.013%（PDA色谱图中的主要共有峰），1.1%～1.8%（ELSD色谱图中的主要共有峰），表明供试品溶液在48 h内稳定。同时发现50 min后，色谱图中再没有特征峰出现，色谱记录时间50 min即可。

2.4.2精密度实验取“2.2”项下的混合标准溶液，按照“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，各色谱峰的峰面积比值RSD均小于3%，表明精密度良好，仪器很稳定。

2.4.3重复性实验取1号样品，按照“2.3”项下的供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进样，PDA色谱图中主要共有峰的峰面积比RSD为0.15%～0.39%，ELSD色谱图中主要共有峰的峰面积比RSD为1.1%～2.8%，表明本方法重复性良好。

2.5指纹图谱的建立根据11批供试品溶液HPLC/PDA/ELSD指纹图谱所给出的峰数、峰值和峰位等相关参数，进行比较分析，得到图1-2所示的指纹图谱共有模式图。

图1　11批知母药材的HPLC-PDA指纹图谱共有模式图Fig.1Mutual mode of HPLC-PDA fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae

图2　11批知母药材的HPLC-ELSD指纹图谱共有模式图Fig.2Mutual mode of HPLC-ELSD fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae

2.6指纹图谱分析与评价

2.6.1共有峰的确定根据11批供试品溶液所得测试结果，确定HPLC-PDA指纹图谱有17个峰为各批样品所共有，同法确定了HPLC-ELSD指纹图谱中的14个共有峰。见图3-4。

图3　知母药材的HPLC-PDA指纹图谱Fig.3HPLC-PDA fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

图4　知母药材的HPLC-ELSD指纹图谱Fig.4HPLC-ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

2.6.2参比峰的选择在各批次样品的HPLCPDA图谱中，芒果苷的峰面积较大，较稳定，所以选取芒果苷的峰（9号峰）为HPLC-PDA图谱的参照峰；同理选取知母皂苷BII的峰（5号峰）作为HPLC-ELSD图谱的参照峰。

2.6.3指纹图谱的相似度评价采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对各批知母药材的指纹图谱进行数据处理，生成对照图谱，计算各样品图谱与对照图谱的相似度，只有10号样品的PDA图谱与对照图谱的相似度在0.9以下，其他都在0.9以上。见表2。

表2　知母指纹图谱相似度评价结果Tab.2Similarity analysis of Rhizoma Anemarrhenae fingerprint

3　讨论

3.1检测器的选择知母中的主要化学成分有甾体皂苷类、双苯吡酮类、多糖类、木脂素类等［16-17］，如果单纯使用PDA检测器，由于甾体皂苷类成分没有紫外吸收，所以，此类成分的含量将无法控制，而ELSD检测器作为通用型检测器，虽然理论上，只要待测物质的沸点高于流动相，就可以使用ELSD检测器检出，但由于灵敏度低，所以，单纯使用ELSD检测器建立的指纹图谱中，会缺少一些含量较低的物质的信息。本实验采用HPLC/PDA/ELSD联用的方式，建立了知母药材的多维指纹图谱，弥补了采用单一检测器的局限性，可以更立体的控制知母药材的质量［18-19］。

3.2检测波长的选择实验采用3D数据采集，记录了供试品溶液在190～400 nm的全波长色谱图，在不同的波长下提取色谱图，当波长低于260 nm时，基线不平，而波长大于260 nm时，各主要色谱峰的吸收又会降低，所以，选取了芒果苷的最大吸收波长258 nm为检测波长。

3.3流动相系统的选择实验考察了乙腈-冰醋酸水溶液和乙腈-甲酸水溶液两个流动相系统，发现使用乙腈-冰醋酸水溶液，各峰的分离度更好，出峰时间分布更均匀，因此，最终选用了乙腈-冰醋酸水溶液作为流动相。

3.4色谱柱的选择实验考察了Waters SunFireTMC18、Waters Symmetry C18、Waters Symmetry ShieldTMRP C18和Dikma Diamonsil C18，结果表明，使用Waters Symmetry ShieldTMRP C18时，各峰分布更均匀，分离度更好，所以采用此色谱柱。

郭晓晔等［20］的研究揭示了栽培“西陵知母”中不同化学成分在一年中的各月份，呈现不同的规律性变化。实验使用的药材均采收于初秋8、9月份，采收于其他季节的知母药材，可能会由于其中某些化学成分的含量处于不同时期，而与本实验建立的对照指纹图谱相似度较低。

［1］卫智权，邓家刚，阎莉，等.芒果苷对慢性炎症大鼠外周血单核细胞髓样分化因子88表达的影响［J］.中国药理学通报，2013，29（4）：482-486.

［2］刘芸，郑瑞.知母醇/水提取物对α-淀粉酶抑制作用研究［J］.陕西中医，2013，34（7）：897-898.

［3］卫智权，阎莉，邓家刚，等.芒果苷对脂多糖诱导的慢性炎症大鼠MAPK通路及血清细胞因子的影响［J］.中草药，2013，44（1）：52-58.

［4］刘卓，隋海娟，闫恩志，等.知母皂苷对脂多糖诱导巨噬细胞炎症介质释放影响［J］.中国公共卫生，2013，29（3）：384-386.

［5］李学坚，杜正彩，邓家刚，等.芒果苷酰化衍生物降血糖活性的研究［J］.时珍国医国药，2013，24（1）：51-53.

［6］马洁桃，张岭，来伟旗，等.芒果苷对L6细胞葡萄糖消耗的影响及其作用机制研究［J］.中国预防医学杂志，2012，13（9）：662-666.

［7］马河，刘园华，张金杰.知母水溶性小分子提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞体外糖代谢的影响［J］.食品与药品，2013，15（1）：26-28.

［8］肖复茜，李洪秀，隋海娟，等.知母皂苷元对高糖引起的体外培养大鼠海马神经元损伤的保护作用［J］.中国药理学通报，2013，29（1）：107-112.

［9］卢英，金英，隋海娟，等.知母皂苷元通过上调PI3K/Akt信号通路减轻淀粉β蛋白诱导的乳大鼠海马神经元突触损伤［J］.中国药理学与毒理学杂志，2013，27（4）：635-640.

［10］王艳，王艳杰，宋少江，等.知母总皂苷对阿尔茨海默病细胞模型的保护作用［J］.实用中医内科杂志，2012，26（6）：6-8.

［11］柳春，王艳杰，王艳，等.知母总皂苷对Aβ25～35诱导的PC12细胞Bax表达的影响［J］.中国老年学杂志，2014，34（18）：5163-5165.

［12］朴日龙，许青松.知母乙醇提取物对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力的影响［J］.陕西医学杂志，2010，39（8）：941-943.

［13］刘芳，李兰芳，刘广杰，等.知母水、醇提取液的急性毒性实验研究［J］.天津中医药，2014，31（6）：361-364.

［14］罗洁，范旭航，崔思娇，等.知母的UPLC指纹图谱及聚类分析［J］.中国现代应用药学，2013，30（1）：28-31.

［15］可维，马春辉，张如隽，等.不同来源知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的研究［J］.药物分析杂志，2008，28（1）：100-103.

［16］王颖异，郭宝林，张立军.知母化学成分的药理研究进展［J］.科技导报，2010，28（12）：110-115.

［17］李习平，石继连，胡还甫.知母的研究概况［J］.岳阳职业技术学院学报，2010，25（1）：90-93.

［18］常艳旭，朱子微，李晋，等.补骨脂抗氧化活性指纹图谱研究［J］.天津中医药，2011，28（2）：158-160.

［19］曹玲，刘莉莉，王连芝，等.多维指纹图谱在中药质量评价中的应用［J］.中国医药导报，2014，11（24）：164-167.

［20］郭晓晔，杨东升，周冠月，等.“西陵知母”有效成分动态积累研究［J］.时珍国医国药，2013，24（1）：74-75.

（本文编辑：高杉，于春泉）

Study on HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

WEI Jing-na1，LIU Zheng-hui1，ZHAO Lin-lin1，GUO Yong-ze2，CHENG Yi2，WEN Chun-xiu3
（1．Tianjin High-Standard Quality Testing Lab，Tianjin 300381，China；2.Tianjin Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research Institute，Tianjin 300381，China；3.Institute of Cash Crops，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science，Shijiazhuang 050051，China）

［Objective］To establish the HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae.［Methods］This experiment had been done on Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）analytical column of 30℃，with a gradient eluted acetonitrile-0.1% acetic acid mobile phase system of 1.0 mL/min.The detection wavelength had been set at 258 nm，N2pressure was 30 Psi，and the temperature of the drift tube was 80℃.［Results］The mutual modes of the HPLC/PDA/ELSD fingerprint were set up under the established condition.The 17 mutual peaks in the HPLC-PDA fingerprint and 14 mutual peaks in the HPLC-ELSD fingerprint of 11 samples were confirmed.［Conclusion］The method that had been established in this experiment is a good method to totally control the quality of Rhizoma Anemarrhenae.

Rhizoma Anemarrhenae；fingerprint；HPLC/PDA/ELSD

R284.1

A

1672-1519（2015）10-0618-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.10

“十二五”科技部国家科技支撑计划项目（2011B A107B064）。

魏静娜（1981-），女，硕士，工程师，研究方向为药品质量分析。

程奕，E-mail：cychengyi@yahoo.com。

（2015-04-27）