蛋白酶体抑制剂万珂对脑缺血再灌注损伤保护作用机制的研究

薛晶等

[摘要] 目的 探讨万珂对脑缺血再灌注后细胞凋亡及线粒体的发生变化程度，探讨对脑缺血起到的保护作用。 方法 将实验于2012年5月—2013年12月期间选用的大鼠15只随机分为万珂治疗组5只、假手术组5只、生理盐水组5只。模型组马上进行万珂0.2 mg/kg尾静脉注射，对照组注射相同量的生理盐水，在24 h的时间点进行取材。免疫组化法测Cyt C、Caspase-3；神经细胞凋亡选择TUNEL法进行检测。结果 假手术组凋亡细胞亦少见，偶见Cyt C、Caspase-3免疫反应阳性细胞，万珂组Cyt C、Caspase-3免疫反应阳性细胞及凋亡细胞明显减少，生理盐水组见大量上述细胞，且两组上述各项数据对比，差异有统计学意义，两组与假手术组上述各项数据对比，差异亦均有统计学意义。 结论 万珂是蛋白酶体抑制剂具有保护线粒体功能，明显的抑制炎症反应高峰形成，缩小脑梗死体积，减轻细胞凋亡，保护神经的作用。

[关键词] 万珂；脑缺血再灌注；凋亡；细胞色素C

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）06（c）-0095-02

[Abstract] Objective To observe the effects of VELCADE on cell apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion and the level of mitochondrial changes and study on its protective effects to cerebral ischemia. Methods 15 laboratory rats from 2012 May to 2013 December were randomly divided into VELCADE groups and pseudo surgery group and saline group with 5 in each group. VELCADE groups received caudal vein injection of 0.2 mg/kg VELCADE and the control groups received saline injection of the same volume and experimental materials were collected after 24 h. Cyt C、Caspase-3 was detected by immunohistochemical and the neuronal apoptosis was detected by TUNEL. Results Fake surgery group apoptosis died cell also rare， occasionally Cyt c， and Caspase-3 immune reaction positive cell， VELCADE group Cyt c， and Caspase-3 immune reaction positive cell and the apoptosis died cell obviously reduced， saline group see large above cell， and two group above the data compared， differences significantly has statistics meaning， two group and fake surgery group above the data compared， differences also are has statistics meaning. Conclusion VELCADE is a proteasome inhibitor， and it has a protective function of mitochondria and can significantly inhibits the inflammatory response to peak form， reduces the volume of cerebral infarction and apoptosis， protects neural function.

[Key words] VELCADE； Cerebral ischemia-reperfusion； Apoptosis ； Cytochrome C

蛋白酶体抑制剂为新型的抗肿瘤药物，2003年已被FDA批准用于临床治疗多发性骨髓瘤，它可通过诱导异常分裂的肿瘤细胞凋亡起到抗肿瘤的作用，目前国外有研究结果显示，蛋白酶体抑制剂还可通过抑制炎症反应因子NF-κBp65、IL-1β的表达有显著的减轻炎症反应的作用[1]，而脑缺血再灌注后脑局部的炎症反应是造成再灌注损伤的重要原因之一，故国外学者将其应用于神经系统疾病的研究，并证实其通过抑制炎症反应，对脑缺血大鼠有减轻神经细胞凋亡的作用，但国内尚无此方面的研究。该实验将其用于脑缺血再灌注大鼠，已证实其可抑制细胞凋亡，减小脑梗塞体积，有很好的脑保护作用，但具体机制不祥，已知细胞凋亡途径有三种，该类药物是通过何种途径抑制凋亡尚不清楚，该实验在2012年5月—2013年12月期间选用15只大鼠为研究对象，欲采用万珂对脑缺血再灌注大鼠进行治疗，观察影响线粒体途径的指标，目的是进一步探讨该类药物的脑保护作用机制，为该类药物扩大临床适应症奠定理论基础，同时也为临床治疗开辟新的途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该实验在2012年5月—2013年12月期间选用15只普通级健康雄性Wistar大鼠， 鼠龄（3～4）个月，体重260～280 g，随机分为假手术组、生理盐水对照组、万珂治疗组每组5只。大鼠大脑中动脉缺血模型采用线栓法制作，脑缺血2 h再灌注即刻给予万珂0.2 mg/kg尾静脉注射，对照组以相同的生理盐水，在脑缺血2 h再灌注24 h取材，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射对大鼠进行麻醉，经心脏灌注固定、取材，将视交叉后脑组织2 mm层面多聚甲醛缓冲液固定24 h，梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续切取同一层面5张切片，切片厚5 μm，用于检测Cyt C、Caspase-3及细胞凋亡。

1.2 检测方法

免疫组化法检测Cyt C、Caspase-3，TUNEL法检测神经细胞凋亡，采用显微镜进行观察，每只大鼠取5张切片选相同部位计数阳性细胞数（400倍），选择数码相机进行拍照。

1.3 统计方法

全部资料选择SAS 9.0版统计软件进行分析，所有计量资料以均数±标准差表示，用t检验。

2 结果

免疫组化法测Cyt C、Caspase-3与细胞凋亡：假手术组凋亡细胞亦少见，偶见Cyt C、Caspase-3免疫反应阳性细胞，万珂组Cyt C、Caspase-3免疫反应阳性细胞及凋亡细胞明显减少，生理盐水组见大量上述细胞，且两组上述各项数据对比，差异有统计学意义，两组与假手术组上述各项数据对比，差异均有统计学意义。见表1。

3 讨论

该研究充分证实脑缺血再灌注后及时应用蛋白酶体抑制剂万珂0.2 mg/kg具有明显的抑制炎症反应高峰形成，很大程度缩小了脑梗死体积，有助于减轻细胞凋亡，保护神经的作用[2]。研究显示在脑缺血时，ATP耗竭可影响蛋白质泛素化的级联反应，并且能够抑制蛋白酶体活性，致使蛋白酶体清除氧化应激蛋白的能力水平显著下降，与此同时氧化应激损害进一步促进对蛋白酶体活性的抑制[3]，这样的恶性循环，造成蛋白聚集及神经元死亡。除此之外依据相关研究显示短暂性脑缺血时大鼠海马CA1区神经元会出现泛素化蛋白聚集过程，线粒体膜上还会呈现出蛋白聚集[4]，因此万珂有助于蛋白聚集的程度，可以引领细胞凋亡过程发生。

线粒体是细胞内重要的细胞器之一，在细胞信号转导和细胞氧化还原状态以及渗透压调节中起非常突出的作用[5]。线粒体即可出现功能与结构的改变，这说明线粒体在早期的细胞凋亡过程中具有启动功能[6]，而细胞凋亡的早期事件是细胞色素C从线粒体释放的过程，CytC在细胞凋亡产生的信号传导过程中起作用是至关重要的。细胞凋亡的过程中信号转导通路的线粒体凋亡通路在细胞生存和死亡中发生了非常重要作用，目前认为凋亡过程的早期信号转导主要通过线粒体途径来完成的[7]。此项研究结果发现应用蛋白酶体抑制剂治疗过程中，Cyt C的释放明显减少，万珂组（34.21±1.82），生理盐水组（46.13±1.55），P<0.05，差异有统计学意义，线粒体凋亡通路中Caspase-3蛋白的表达亦相应减少，万珂组（32.04±1.31），生理盐水组（52.49±1.20），P<0.05，差异有统计学意义，同时凋亡的细胞也明显减少，万珂组（33.14±2.56），生理盐水组（52.25±4.12），P<0.05，差异有统计学意义。经过查证相关资料显示[7]，此项研究结果与国外其他报道的研究水平相一致。该研究已证实蛋白酶体抑制剂可通过抑制线粒体凋亡途径有脑保护作用，此项研究结果在国内外尚未见相关报道。目前深入研究其与脑缺血之间的关系，可能为临床上减轻脑缺血损伤提供新的治疗方案，使万珂有望成为很有前景的药物靶标。下一步将进一步研究线粒体结构方面的变化，同时研究其对血脑屏障的通透情况，为其临床应用奠定理论基础。

总之，此项研究还发现应用蛋白酶体抑制剂治疗过程中，Cyt C的释放明显减少，线粒体凋亡通路中Caspase-3蛋白的表达亦相应减少，同时凋亡的细胞也明显减少，其作用机制可能主要通过减少Cyt C的释放、减轻炎症反应过程，阻断了线粒体凋亡途径，抑制脑细胞凋亡，从而发挥大脑保护作用。

[参考文献]

[1] Fang-Ting， Chen Chung-May，Yang Chang-Hao， et al.The protective effects of the proteasome inhibitor bortezomib （velcade） on ischemia-reperfusion injury in the rat retina[J].Plos one，2013，8（5）： e64262.

[2] 薛晶.万珂对脑缺血再灌注损伤的保护作用机制[J].中国实用医药，2014，9（25）：256.

[3] Jie， Cui Zhi，Li Ling-bo，Qian Qin，et al.Reducing the oxidative stress mediates the cardioprotection of bicyclol against ischemia-reperfusion injury in rats[J].Journal of Zhejiang University，2013，14（6）：487.

[4] LiJ， Liu N， Wang Y，et al. Inhibition of EphA4 signaling after ischemia-reperfusion reduces apoptosis of CA1 pyramidal neurous[J].Neurosci Lett，2012，518（2）：92.

[5] Huang XP， Tan H， Chen BY， et al.Astragalus extract allebiates nerve injury after cerebral ischemia by improving energy metabolism and inhibiting apoptosis[J].Biol Pharm Bull，2012，35（4）：449.

[6] Maik，Hüttemann Stefan，Helling ThomasH，et al.Regulation of mitochondrial respiration and apoptosis through cell signaling： cytochrome c oxidase and cytochrome c in ischemia/reperfusion injury and inflammation[J].Biochimica et biophysica acta，2012，1817（4）： 598.

[7] 张宁.线粒体分裂抑制剂在大鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制[J].中华神经医学杂志，2013，12（4）：354.

（收稿日期：2015-03-21）