遗传病推断复合扩增体系的构建

孙启凡，赵 蕾，徐 颖，王 玮，龙 源，马纪强，魏以梁，赵兴春，叶 健，李彩霞，*

（1.公安部物证鉴定中心，北京 100038；2.北京市现场物证检验工程技术研究中心，北京 100038；3.法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038； 4.中国刑警学院， 沈阳 110854；5.山西医科大学，太原 030024；6.清华大学医学院生物医学工程系，北京 100084；7.天津医科大学表观遗传中心，天津 300070）

遗传病推断复合扩增体系的构建

孙启凡1，2，3，赵 蕾1，2，3，徐 颖1，4，王 玮1，5，龙 源1，马纪强1，魏以梁6，7，赵兴春1，2，3，叶 健1，2，3，李彩霞1，2，3，*

（1.公安部物证鉴定中心，北京 100038；2.北京市现场物证检验工程技术研究中心，北京 100038；3.法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038； 4.中国刑警学院， 沈阳 110854；5.山西医科大学，太原 030024；6.清华大学医学院生物医学工程系，北京 100084；7.天津医科大学表观遗传中心，天津 300070）

目的 通过对人类DNA进行突变基因检测推断该DNA供者是否患特定遗传病，建立对DNA样本突变

法医遗传学；等位基因特异性PCR；毛细管电泳；遗传性耳聋；β-地中海贫血；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症

遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病，对人类DNA进行检测理论上可推断该DNA供者是否患有某种类型的遗传病［1］。多数遗传病具有地域性或家族遗传性，因此，挑选特定的疾病类型，通过对DNA的检测，可推断供者是否可能具备遗传病特征，从而间接推断DNA供者的地域来源、生活习性等，一定程度上能够缩小嫌疑人的目标人群，为案件侦查提供线索。而针对突变基因位点或致病基因建立简便高效的检测方法是开展此类研究需要解决的关键问题。等位基因特异性PCR（allele specific PCR， ASPCR）技术是一种简便易行的基因序列分析方法［2］，根据基因的碱基序列差异设计等位基因特异性引物，通过PCR 技术获得等位基因特异性的扩增产物，然后通过电泳直接分析条带的有无而最终确定突变分型。本文基于等位基因特异性PCR和毛细管电泳技术，建立了一个可同时检测遗传性耳聋、β-地中海贫血（β-Mediterranean anemia）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症三类遗传疾病的复合扩增技术，适用于国内一般法医遗传学实验室。

1 材料和方法

1.1 样本及DNA提取

收集健康个体（北京）样本（血卡或外周静脉血）20份，301医院帮助收集耳聋患者DNA样本35份；血卡样本使用QIAamp® DNA Mini M48（德国Qiagen公司）提取DNA，新鲜外周静脉血使用QIAamp® DNA Blood Midi Kit（德国Qiagen公司）提取血样的DNA。使用AB7500型荧光定量PCR仪（美国Life Technologies公司）进行DNA定量。

1.2 位点选择及引物设计

根据3种疾病各突变位点在中国人群中的出现概率，挑选了20个位点进行体系构建。引物设计时选择HEX和FAM两种荧光对引物对中的上游引物进行特异性标记。

1.3 复合扩增体系构建及检测分析

使用ABI 9700 PCR仪（美国Life Technologies公司）扩增。5.0 µL PCR体系，包含：0.5 µL等比例混合的引物混合物，0.05 µL的dNTP （10 mM），0.5 µL 10×PCR buffer（15 mM Mg2+），0.7 µL MgCl2（25 mM Mg2+），0.2 µL快速启动酶Hotstar Taq plus（5 U/μ L），1.05 µL去离子水，2 µL模板DNA。

扩增条件：95℃ 5 min；之后94℃ 30 s，59℃ 1 min，72℃ 1 min，共40个循环；60℃ 45 min。

使用ABI 3100XL型自动遗传分析仪（美国Life Technologies公司）进行电泳，利用Genemapper ID v3.2 软件（美国Life Technologies公司）分析数据。

2 结 果

2.1 疾病类型选取原则

对中国人群中常见遗传病情况调查研究，认为适合用于DNA人物特征推断研究的遗传病需具备的特征包括：（1）具备一定的发病率；（2）表型特征、地域特征或家族聚集特征明显；（3）具备一定的临床研究基础，突变位点清楚。本文选择了三种单基因遗传病作为研究对象，分别是：β-地中海贫血、遗传性耳聋、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症。β-地中海贫血是一类以珠蛋白β链合成不足或缺失为特征的常染色隐性遗传性疾病，在我国主要分布在南方，如广东、广西、海南、香港等地区。其中广东和广西两省人群中，β-地贫基因携带率高达23.98%［3］。耳聋是一类具有显著遗传异质性的疾病，是影响交流的最常见的感觉障碍，新生儿重度以上先天性耳聋发病率为1/1000［4］。G6PD是最常见的人类酶缺陷病之一，常见于我国南方人群，尤其是两广地区［5］。

2.2 体系构建

复合扩增体系共包含三种疾病的20个位点，其中耳聋突变位点11个，β-地中海贫血突变位点6个，G6PD缺乏症突变位点3个。针对每个突变位点建立两组引物，野生型和突变型各一对，分两管扩增，其中野生型20个位点为一组，突变型20个位点为一组，各突变位点及引物信息见表1。

表1 各突变位点及引物信息表Table1 Primer information for each mutation sites

经反复试验，最后获得的复合扩增体系可对所有20对突变位点成功扩增，得到分型结果。对于正常样本A，其野生组所有位点均可获得分型峰，突变组所有位点均没有分型峰，其复合荧光检测体系结果分别见图1。对于突变样本B（以235delG突变型为例），其野生型除位点235delG不能获得分型峰外，其余位点均可获得相应分型，而其突变组只有位点235delG能够获得分型峰，其余位点均无分型峰，其复合荧光检测体系结果分别见图2。

图1 样本A野生组（左）和突变组（右）复合荧光检测结果Fig.1 DNA profi les of wild type group （left） and mutation type group （right） for sample A

2.3 有效性验证

图2 样本B野生组（左）和突变型（右）复合荧光检测结果Fig.2 DNA profi les of wild type group （left） and mutation type group （right） for sample B

为了验证所构建复合扩增体系的有效性，从301医院采集部分耳聋患者DNA样本。使用构建的复合扩增体系进行验证。共检测35份样本，检测结果如表2所示，与已知信息一致。结果证明，使用该复合扩增体系可有效检测相应的单基因遗传病的基因型。

表2 抽样样本检测结果统计表Table2 Test result of samples collected from a hospital

3 讨 论

为适应日益复杂的犯罪形势，对现场生物物证所能提供的信息进行深入挖掘成为法医遗传学的研究重点。该研究主要包含三方面研究内容，分别是种族来源推断研究，人类学、生理学特征（面貌、年龄等）推断研究，以及病理特征推断研究［6］。我国虽然是个多民族国家，但主要还是属于东亚人种，只有位于欧、亚交界处的新疆维吾尔族、塔吉克族等民族属于欧亚混合人种。目前虽然我国科学家也已建成较为成熟的种族推断技术方法，可推断大洲人群及典型的混合人群［7］，而人群进一步细分技术，尚处于攻关阶段。而外貌特征刻画，国际上较为成熟的肤色、虹膜颜色、毛发颜色等的推断技术［8］，也并不适用于国内人群。本文首次尝试对疾病特征进行推断，选取的三类遗传病较为典型，均为单基因遗传病，单位点的突变即可能致病，因此可检测性强。同时，三类疾病表型特征明显，一旦推测出检材DNA带有致病基因，即可对其相应表型特征进行大胆预测。本研究建立的检测技术，所需仪器耗材均为普通法医DNA实验室常用，无需另外配备，可推广性较强。

在进一步开展疾病特征推断相关研究过程中，笔者认为仍有许多问题及难点需待解决。第一，许多遗传病为多基因遗传，即使具备发病率较高，表型特征明显等特点，但由于不属于简单的孟德尔遗传，且缺乏充分的基础研究数据而导致直接进行法医学应用难度较大，如斑秃等；第二，公安系统开展此类研究，缺乏足够的样本数据支撑，难以从实际角度充分验证试验结果；第三，对DNA供者可能持有的致病基因进行检测有可能涉及伦理问题，还有待进一步讨论。总之，疾病特征刻画领域的研究工作，涉及面广，但前景毋庸置疑。公安机关作为应用部门，可充分加强与科研院所等基础研究部门、医院等样本资源丰富的部门开展合作，协同创新，推动该研究领域的深入发展。

［1］ 杨保胜.遗传病与分子生物学［M］.北京：科学出版社， 2012.

［2］ Newton CR， Graham A， Heptinstall LE， et al.Analysis of any point mutation in DNA.The amplification refractory mutation system （ARMS） ［J］.Nucleic Acids Res， 1989，17（7）:2503-2516.

［3］ 胡华.芯片毛细管电泳基因突变检测技术平台的建立及其应用研究［D］.重庆:第三军医大学，2008.

［4］ 李彩霞.一种全新基因突变检测芯片的研究及在耳聋筛查中的应用［D］.北京:清华大学，2007.

［5］ 谭昌渊.G6PD缺乏症基因诊断新方法的建立［D］.上海:上海交通大学，2008.

［6］ 孙启凡，赵蕾，江丽，等.DNA来源人特征刻画的法庭科学应用研究概况［J］.刑事技术，2015，40（3）:232-235.

［7］ Branicki W， Liu F， van Duijn K， et al.Model-based prediction of human hair color using DNA variants ［J］.Hum Genet，2011，129（4）:443-454.

［8］ Wei YL， Wei L， Zhao L， et al.A single tube 27-plex SNP assay for estimating individual ancestry and admixture from three continents ［J］.Int J Legal Med， 2015.［Epub ahead of print］

本文引用格式：孙启凡， 赵蕾， 徐颖， 等.遗传病推断复合扩增体系的构建 ［J］.刑事技术， 2015，40（5）:364-367.

A Novel Multiplex PCR Assay for the Inference of Genetic Diseases

SUN Qifan1，2，3， ZHAO Lei1，2，3， XU Ying1，4， WANG Wei1，5， LONG Yuan1， MA Jiqiang1， WEI Yiliang6，7， ZHAO Xingchun1，2，3，YE Jian1，2，3， LI Caixia1，2，3，*
（1.Institute of Forensic Science， Ministry of Public Security， Beijing 100038， China； 2.Beijing Engineering Research Center of Crime Scene Evidence Examination， Beijing 100038， China； 3.Key Laboratory of Forensic Genetics， Ministry of Public Security， Beijing 100038， China； 4.National Police University of China， Shenyang 110854， China；5.Sh anxi Medical University， Taiyuan 030024， China； 6.Department of Biomedical Engineering， School of Medicine， Tsinghua University， Beijing 100084， China； 7.2011 Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics， Tianjin Medical University，Tianjin 300070， China）

Objective Genetic disease， usually controlled by pathogenic genes， occurs over mutation in the relevant genetic material.Theoretically， scientists can infer from the DNA typing whether a subject is prone to some kind of genetic diseases because of the regionality and/or inheritance of most these illnesses able to link the DNA donor with certain zone of the typed DNA.Therefore， the inference of unknown supplier of evidential substance， based on the information of some genetic diseases parsed with the relative DNA， may become an important research focus in forensic community due to the common fact that target suspects and/or any other clues are not easily exposed through the biologic samples collected from the scenes in criminal cases.Here， a simple and effi cient method was tried to establish for the detection of certain pathogenic genes.Methods Allele specifi c PCR （ASPCR） was conducted in two aliquots of each separately subjected to normal and mutant amplifi cation with the allele specific primers designed according to the sequenced gene， and followed by capillary electrophoresis for gene sequencing to get its genotype.Results A newly developed panel of 20 genes， synchronously detecting three kinds of genetic diseases based on allele specifi c PCR technique and capillary electrophoresis， were presented.The panel contained 11 disease genes of Genetic Deafness （one of the most common sensory disorders that affect communication）， 6 genetic loci of Beta Mediterranean anemia （of high incidence in China’s southern parts such as Guangdong， Guangxi and Hong Kong） and 3 loci of Glucose-6-phosphate dehydrogenase （G6PD） defi ciency （having its higher incidence in southern China， too）.Conclusions The multiplex assay， performed with PCR and the capillary electrophoresis available at most forensic genetic laboratories， is very likely to be a convenient and cost-effective choice for criminal investigations.

forensic genetics； allele specifi c PCR； capillary electrophoresis； genetic deafness；β-Mediterranean anemia；glucose-6-phosphate dehydrogenase defi ciency检测的方法，运用于法庭科学的DNA来源人特征刻画领域，为案件侦查提供线索。方法 根据遗传性耳聋、β-地中海贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症三类遗传疾病各突变位点在中国人群中的出现概率，挑选了20个位点，设计引物，利用等位基因特异性PCR和毛细管电泳技术构建推断这三类遗传疾病的PCR检测体系。结果构建了包含20个突变位点，能够同时检测遗传性耳聋、地中海贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）三类遗传疾病的毛细管电泳复合扩增实验体系。结论 在法医学实验室开展检材DNA来源人的疾病特征推断是可行的。通过进一步研究发展，该技术有望在刑事案件侦查中发挥作用。

10.16467/j.1008-3650.2015.05.004

公安部科技强警基础工作专项项目（No.2013GABJC037）

孙启凡（1985—），女，山东枣庄人，主检法医师，博士，研究方向为法医遗传学。 E-mail: sunqifan@cifs.gov.cn

李彩霞，女，副主任法医师，博士，研究方向为法医遗传学。 E-mail: licaixia@tsinghua.org.cn

DF795.2

A

1008-3650（2015）05-0364-04

2015-07-21