补阳还五汤对家兔易损斑块内新生血管的影响研究*

庞晓丽，杨　琳，曾文赟，索艳荣，张云莎，姜希娟

补阳还五汤对家兔易损斑块内新生血管的影响研究*

庞晓丽，杨琳，曾文赟，索艳荣，张云莎，姜希娟

（天津中医药大学中西医结合学院，天津300193）

［目的］研究补阳还五汤对兔动脉粥样硬化斑块内新生血管的影响及机制。［方法］选取50只雄性新西兰白兔为研究对象，将其随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组，12周后处死。取斑块组织苏木精-伊红（HE）染色评估斑块破裂出血情况；取冰冻斑块组织，采用免疫荧光染色，评估血管密度情况；采用酶联免疫吸附（ELISA）及蛋白印记测定血中及斑块内碱性成纤维生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板源性生长因子（PDGF）表达情况。［结果］补阳还五汤组斑块破裂数明显少于模型组（P＜0.05）斑块内bFGF、PDGF表达与模型组比较有统计学差异（P＜0.05）。［结论］补阳还五汤具有稳定易损斑块的作用，其机制可能与增加斑块内bFGF、PDGF表达，促进血管成熟有关。

动脉粥样硬化；易损斑块；新生血管；补阳还五汤

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.11.09

易损斑块是造成急性冠脉综合征的主因，病理特点为丰富的脂核、薄的纤维帽和大量炎细胞浸润［1-2］。近年来研究显示，斑块内存在不成熟新生血管，这类血管通透性和脆性增加，容易导致斑块内炎细胞大量浸润和血肿，进而形成易损斑块［3-4］。因此，促进斑块内新生血管成熟有利于斑块稳定。补阳还五汤具有补气活血、通经活络的功效，临床上广泛用于缺血性心、脑血管病的治疗。现代药理学研究显示，该方可通过改善缺血区血供保护心、脑功能［5-8］。故本实验通过建立家兔动脉粥样硬化（AS）模型，研究补阳还五汤对斑块内新生血管的影响及机制。

1　材料与方法

1.1药物制备补阳还五汤药物购于同仁堂药业（北京），其中黄芪125 g，川芎3 g，当归6 g，赤芍5 g，桃仁3 g，红花3 g，地龙3 g。将上述药物用水煎煮2次，时间30 min，合并煎煮液后浓缩成含生药相当于1 kg/L。

1.2实验动物与分组选取健康新西兰白兔50只，体质量2.6～3.0 kg，3～4月龄（国家卫生研究院提供）。动物适应性喂养2周后，采用随机数字表法将家兔分为3组：假手术组10只、模型组20只、补阳还五汤组20只。模型组和补阳还五汤组给予高脂饮食4周，4周后行腹主动脉球囊损伤术，继续高脂饮食4周，继而两组改为正常饮食4周。补阳还五汤组在正常饮食的基础上给补阳还五汤灌胃，每日2次，连续4周；假手术组仅切开皮肤，分离腹主动脉后即缝合，正常饮食10周。干预结束后给予两次药物触发斑块破裂：1）在处死动物前24 h和48 h分别给予以蝰蛇毒0.15 mg/kg腹膜下注射。2）于30 min后耳缘静脉注射组胺0.02 mg/kg。

1.3观察方法与指标1）处死家兔后取腹主动脉斑块处苏木精-伊红（HE）染色评价斑块破裂情况。2）取斑块组织冰冻切片，采用血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）和异硫氰酸荧光素（FITC）标记，免疫荧光染色血管内皮细胞，评估血管密度情况。3）取家兔外周血，离心后取上清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）评价外周血中碱性成纤维生长因子（bFGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血小板源性生长因子（PDGF）含量。4）取斑块组织提取蛋白，采用蛋白印迹方法评价斑块内bFGF、VEGF、PDGF表达情况。

1.4统计学分析采用SPSS 18.0统计软件包进行分析，计量数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，计数资料采用率表示，组间率的比较采用卡方检验，以P＜0.05定为差异有统计学意义。

2　结果

2.1斑块破裂情况模型组和补阳还五汤组均形成动脉粥样硬化斑块，其中模型组形成的粥样斑块具有较大脂核和薄的纤维帽。药物触发后，模型组有14只发生斑块破裂出血，补阳还五汤组仅有7只出血斑块破裂，两组比较具有统计学差异（P＜0.05），见表1。

表1　两组家兔动脉粥样硬化斑块破裂情况比较Tab.1　Comparison of the ruptured plaque numbers of rabbits between two groups

2.2斑块内血管情况假手术组未见血管，模型组和补阳还五汤组可见新生血管，如图1，两组在血管密度方面没有统计学差异，见表2。

图1　各组斑块内血管情况比较（×100）Fig.1 Comparison of the microvessels in plaque of each group（×100）

表2　各组斑块内新生血管密度比较（±s）Tab.2　Comparison of the density of microvessels in plaque of each groups（±s）

表2　各组斑块内新生血管密度比较（±s）Tab.2　Comparison of the density of microvessels in plaque of each groups（±s）

注：与模型组比较，*P＞0.05。

组别动物数新生血管密度（根/mm2）假手术组100模型组1017.55±0.76*补阳还五汤组1016.27±0.52*

2.3外周血中bFGF、VEGF、PDGF含量补阳还五汤组在VECF、PDGF、bFGF外周血含量方面与假手术组比差异有统计学意义（P＜0.05），然而与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3　各组外周血中血管生成因子含量测定比较±s）Tab.3　Comparison of the angiogenesis factors in peripheral blood in each group±s）

表3　各组外周血中血管生成因子含量测定比较±s）Tab.3　Comparison of the angiogenesis factors in peripheral blood in each group±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＞0.05。

组别假手术组模型组补阳还五汤组动物数10 10 10 VEGF（ng/L）PDGF（ng/L）bFGF（ng/L）26.03±9.66070.75±08.66207.50±54.13 31.78±8.35083.69±20.76227.83±78.87 31.71±6.75*△105.09±22.18*#234.08±80.99*#

2.4斑块内bFGF、VEGF、PDGF表达3组VEGF表达差异无统计学意义（P＞0.05），在bFGF、PDGF表达方面补阳还五汤组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2　各组VEGF、bFGF、PDGF表达情况Fig.2Comparison of the protein expression of VEGF，bFGF，PDGF in each group

3　讨论

3.1补阳还五汤可抑制斑块破裂出血中医认为：动脉粥样硬化（AS）证候要素主要有血瘀、痰浊、气虚，为本虚标实之病，标实为血瘀、痰浊，本虚为气虚［9-10］，故临床上常以补气、活血药物治疗此病。补阳还五汤是收载于《医林改错》中的经典方剂，全方由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁等7味中药组成，具有益气、活血、通络之功效［11］。研究显示，该药对动脉粥样硬化有一定的疗效［12-13］。由表1可以看出，补阳还五汤能够减少家兔斑块破裂出血，对于控制动脉粥样硬化斑块进展有一定作用。

3.2补阳还五汤抑制斑块破裂与促进斑块内新生血管成熟有关新生血管成熟的标志是基底膜的形成，表现为内皮细胞对周细胞的募集，从而形成有周细胞包绕的稳定的血管［14-15］。研究显示，VEGF调控血管发芽，而PDGF-B和bFGF则在调控周细胞募集方面发挥重要作用［15-16］。内皮细胞分泌的PDGF-B与周细胞表面的受体PDGF受体-β（PDGFR-β）结合，促进周细胞的增殖与迁移，bFGF可协调PDGF-B/PDGFR-β进一步强化新生血管成熟［17］。近年来研究表明AS斑块内存在大量不成熟新生血管，由于其血管渗透性强，血液中的炎症因子可顺利进入斑块内，进而引发斑块不稳定［17］。本研究发现，补阳还五汤组和模型组斑块内均有新生血管（如图2所示），然而补阳还五汤组斑块破裂却少于模型组，说明两组斑块内血管在成熟度方面存在差异。故本研究采用ELISA和蛋白印迹等方法，评估各组血管生成因子VEGF、bFGF、PDGF的表达情况。结果显示，与模型组比较补阳还五汤组并不能有效增加外周血中VEGF、bFGF、PDGF的含量，而在斑块内bFGF、PDGF的表达却明显增加。由此可以说明，一方面，补阳还五汤在治疗AS时只针对斑块内血管，并不对全身血管新生产生影响，从侧面印证了它的安全性；另一方面，补阳还五汤通过增加斑块内bFGF、PDGF表达，促进新生血管成熟与稳定，进而稳定斑块。

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（本文编辑：马英，滕晓东）

Research the mechanism of Buyang Huanwu decoction on angiogenesis in vulnerable plaque in rabbits

PANG Xiao-li，YANG Lin，ZENG Wen-yun，SUO Yan-rong，ZHANG Yun-sha，JIANG Xi-juan
（College of Combination of Traditional Chinese and Western Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To explore the mechanism of Buyang Huanwu decoction（BYHWD）on angiogenes in vulnerable plaque in rabbits.［Methods］The vulnerable plaque model was reproduced by operation on abdominal aorta endothelium for inducing sacculus pull injury with the foraging with high cholesterol lipid feeding.Rabbits were divided into three groups:model group，sham-operation group and BYHWD group.The experiment lasted for 12 weeks.After killing at the end of experiment，the samples of abdominal aorta were collected for HE staining to accounting the number of rupture plaques，using immunofluorescence staining to evaluate the density of microvessels，detecting the protein content of VEGF，bFGF，PDGF in plaque and evaluating the content of VEGF，bFGF，PDGF in the serum of peripheral blood.［Results］It was found that the number of plaque rupture in BYHWD group was obviously less than model group by HE observation（P＜0.05）.The expression of bFGF，PDGF in plaque in BYHWD was statistically significant（P＜0.05），compared with model group and sham-operated group.［Conclusion］BYHWD can stable the vulnerable plaque，and the mechanism may be related to increasing the expression of bFGF，PDGF and then promoting the microvessels maturation in plaque.

atherosclerosis；vulnerable plaques；angiogenesis；Buyang Huanwu decoction

R743.3

A

1672-1519（2015）11-0672-03

国家自然基金资助项目（81102699，81173413，81202797）。

庞晓丽（1976-），女，在职博士，副教授，主要从事中西医结合心血管基础研究。

姜希娟，E-mail:1371409370@qq.com。

（2015-06-27）