FOXQ1和E-cadherin在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

于海峰，张逊，徐美林，王菁，卢喜科

FOXQ1和E-cadherin在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

于海峰1，张逊2△，徐美林3，王菁3，卢喜科2

目的探讨叉头框蛋白Q1（FOXQ1）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学法检测42例ESCC组织（ESCC组）及其癌旁正常食管鳞状上皮组织（正常组）中FOXQ1和E-cadherin的表达情况，分析其表达与患者临床病理特征及预后的关系。结果ESCC组FOXQ1的阳性表达率高于正常组（64.29%vs 28.57%，χ2=5.384，P＜0.05），E-cadherin的阳性表达率低于正常组（52.38%vs 90.48%，χ2=7.691，P＜0.05）。FOXQ1的表达强度在不同TNM分期及不同淋巴结转移情况间的差异有统计学意义，E-cad⁃herin的表达强度在不同浸润深度、分化程度、TNM分期和淋巴结转移情况间的差异有统计学意义。ESCC组织中FOXQ1和E-cadherin的表达呈负相关（r=-0.412，P＜0.05）。FOXQ1高表达者的5年生存率低于低表达者（18.52%vs 66.67%，χ2=9.737，P＜0.05），E-cadherin高表达者的5年生存率高于低表达者（59.09%vs 10.00%，χ2= 10.996，P＜0.05）。COX比例风险回归模型分析结果显示，FOXQ1高表达、E-cadherin低表达、有淋巴结转移是影响ESCC患者预后的独立危险因素。结论FOXQ1和E-cadherin在ESCC组织中的表达呈现较好的相关性，联合检测两者的表达对于ESCC患者的预后判断及指导治疗具有一定的临床价值。

食管肿瘤；癌，鳞状细胞；钙黏着糖蛋白类；预后；免疫组织化学；叉头框蛋白Q1；E-钙黏蛋白

食管癌是我国最为高发的恶性肿瘤之一，食管鳞状细胞癌（ESCC）为食管癌的主要病理类型，其发病率和死亡率均较高［1］。食管癌的发病机制目前仍不明确，且其预后较差，影响其预后的相关基因是近年来的研究热点。叉头框蛋白Q1（forkhead box Q1，FOXQ1）是一个具有高度保守的叉头框（FOX）结构的转录因子，在肿瘤的侵袭和远处转移过程中起重要作用［2］。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是广泛分布在上皮组织中的跨膜糖蛋白，具有促进上皮细胞间相互黏附和保持组织结构完整性的作用［3］。肿瘤组织中FOXQ1和E-cadherin的表达及其相关机制已有报道，但综合研究二者在食管癌的发生发展及转移中作用的报道较少，本研究采用免疫组织化学方法检测ESCC组织和正常食管鳞状上皮组织中FOXQ1和E-cadherin的表达情况，分析FOXQ1和E-cadherin与ESCC患者临床病理特征及预后之间的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2007年1月—2009年6月天津市胸科医院胸外科收治的ESCC患者42例，其中男36例，女6例，年龄42～77岁，中位年龄62岁。按照国际抗癌联盟（UICC）2009年修订的第7版食管癌TNM分期标准分为：Ⅰ期4例、Ⅱ期21例、Ⅲ期17例。其中高分化7例、中分化24例，低分化11例。有淋巴结转移18例，无淋巴结转移24例。病变位于上段6例，中段26例，下段10例。取其手术切除的ESCC标本42例（ESCC组），均经本院病理科医师复阅HE切片证实为ESCC，术前未经放化疗；另取其癌旁正常食管鳞状上皮组织42例（正常组）。所有标本的使用均经天津市胸科医院伦理委员会批准，并取得患者或家属的知情同意。并通过电话或门诊等方式对患者进行随访，随访时间为手术之日起至死亡或末次随访时间，截至2014年6月1日。

1.2材料和试剂兔抗人FOXQ1单克隆抗体购自Abcam公司，鼠抗人E-cadherin单克隆抗体购自上海长岛生物技术开发有限公司，快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物、粉剂型抗原修复液（柠檬酸法）、PBS磷酸盐缓冲液及二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3免疫组化检测方法标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋后连续切片，厚度4 μm，采用常规免疫组织化学SP法检测，FOXQ1一抗稀释浓度为1∶100，E-cadherin一抗稀释浓度为1∶50，实验步骤严格按照各试剂说明书进行，抗原修复采用柠檬酸缓冲液高温高压热修复。阳性对照采用已知的阳性切片，采用PBS代替一抗做阴性对照。

1.4阳性结果判断淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。根据染色细胞百分率和染色程度进行评定和分析：每例任意观察10个高倍视野（×400），每个视野计数100个细胞，阳性细胞率=阳性细胞数/观察细胞数×100%。FOXQ1表达参考Liang等［4］的判定标准：≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度：黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将阳性细胞率得分和染色强度得分相乘即为最后得分：0～3分定义为低表达，4～12分定义为高表达。E-cadherin表达的判定标准：阳性细胞数＜10%为低表达，≥10%为高表达［5］。

1.5统计学方法采用SPSS 17.0软件进行处理，计数资料比较采用χ2检验，FOXQ1和E-cadherin的相关性用Spear⁃man等级相关进行检验，对生存数据采用Kaplan-Meier分析并绘制生存曲线，应用Log-rank检验差异性，预后因素分析采用COX回归，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.12组 FOXQ1和 E-cadherin的阳性表达情况FOXQ1和E-cadherin在正常组及ESCC组中均有表达。FOXQ1的阳性表达主要在细胞质，部分细胞核亦有表达，E-cadherin的阳性表达主要位于细胞膜，部分位于细胞质，见图1～4。FOXQ1在ES⁃CC组中的阳性表达为高表达，在正常组中的阳性表达为低表达，ESCC组FOXQ1的阳性表达率高于正常组（P＜0.05）。E-cadherin在ESCC组和正常组中的阳性表达均为高表达，但ESCC组E-cadherin的阳性表达率低于正常组（P＜0.05），见表1。

Tab.1　Comparison of positive expressions of FOXQ1 and E-cadherin between two groups表1　2组FOXQ1和E-cadherin的阳性表达情况　例（%）

2.2FOXQ1和E-cadherin的表达与ESCC患者临床病理特征的关系不同TNM分期及不同淋巴结转移情况间FOXQ1的表达强度差异有统计学意义（P＜0.05），不同性别、年龄、肿瘤部位、浸润深度和分化程度间FOXQ1的表达强度差异均无统计学意义；不同浸润深度、分化程度、TNM分期和淋巴结转移情况间E-cadherin的表达强度差异有统计学意义（P＜0.05），不同性别、年龄和肿瘤部位间E-cad⁃herin的表达强度差异均无统计学意义，见表2。

2.3FOXQ1和E-cadherin在ESCC组中表达的相关性分析ESCC组中FOXQ1和E-cadherin的表达呈负相关（r=-0.412，P＜0.05），见表3。

Tab.2　Comparison of expression levels of FOXQ1 and E-cadherin with different clinicopathological characteristics in ESCC groups表2　FOXQ1和E-cadherin的表达与ESCC患者临床病理特征的关系　例（%）

Tab.3　Correlation between the expression of FOXQ1 and E-cadherin in ESCC表3　ESCC组织中FOXQ1和E-cadherin的相关性　（例）

2.4FOXQ1和E-cadherin的表达与ESCC患者预后的关系42例ESCC患者随访时间为1～65个月，中位随访时间46个月。FOXQ1高表达者的5年生存率（18.52%）低于低表达者（66.67%），差异有统计学意义（χ2=9.737，P＜0.05）。E-cadherin高表达者的5年生存率（59.09%）高于低表达者（10.00%），差异有统计学意义（χ2=10.996，P＜0.05），见图5、6。

Fig.5　Kaplan-Meier survival curves for ESCC patients with regard to FOXQ1 expression图5　FOXQ1的表达与ESCC患者生存时间的关系

Fig.6　Kaplan-Meier survival curves for ESCC patients with regard to E-cadherin expression图6　E-cadherin的表达与ESCC患者生存时间的关系

2.5多因素COX回归模型分析以是否有淋巴结转移（0=否，1=是）、分化程度（0=低分化，1=中分化，2=高分化）、浸润深度（1=T1～T2，2=T3～T4）、性别（1=男，2=女）、肿瘤部位（0=上段，1=中段，2=下段）、年龄（1=60岁及以下，2=60岁以上）、FOXQ1高表达（0=否，1=是）、E-cadherin低表达（0=否，1=是）为自变量，以生存时间为因变量，应用COX比例风险回归模型进行分析。结果显示，FOXQ1高表达、E-cadherin低表达、有淋巴结转移是影响ESCC患者预后的独立危险因素，见表4。

Tab.4　Analysis of various prognostic factors in patients with ESCC表4　COX比例风险回归模型分析结果

3　讨论

FOX家族成员众多，在不同种属中已证实的FOX家族成员有100多个，分属19个亚家族，分别被命名为FOXA～S［6］。FOX家族蛋白功能涉及细胞周期调控、生物老化、免疫调节等多种生物学过程，其突变和表达异常与肿瘤发生、发展和转移有关。FOXQ1基因属于FOXQ亚族成员之一，在乳腺癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等肿瘤的发生、发展中的作用已有报道，但在食管癌发生、发展中的作用研究较少。Zhang等［2］研究发现在乳腺癌中FOXQ1基因与E-cadherin蛋白的核心启动子区的E-box结合，抑制E-cadherin蛋白的表达，从而引起乳腺癌的发生、发展及转移。Liang等［4］研究发现FOXQ1基因在胃癌中高表达，且与肿瘤体积、分化程度、淋巴结转移情况及TNM分期存在显著相关性，表明FOXQ1基因高表达与胃癌的进展和预后密切相关。本研究结果显示，FOXQ1在正常食管鳞状上皮组织中呈低表达，而在大部分ESCC组织中表达显著上调，其表达强度在不同肿瘤TNM分期及淋巴结转移情况之间的差异有统计学意义，且FOXQ1高表达是影响ESCC患者预后的独立危险因素之一，与上述研究结果基本一致。

E-cadherin是一种钙依赖性跨膜糖蛋白，介导上皮细胞之间的黏附，形成中间连接，维持组织结构和完整性。E-cadherin高表达可抑制肿瘤转移，E-cadherin表达下降或缺失，细胞黏附力下降，造成细胞容易游离而向外周浸润性生长，一旦获得转移的必要条件，就可脱离原发灶而发生侵袭和转移［3］。近年来在非小细胞肺癌、食管癌、胃癌等肿瘤的研究中证实，E-cadherin表达降低与肿瘤的分化、侵袭和转移有显著相关性［7］。有研究发现食管癌中的E-cad⁃herin阳性表达率显著低于正常食管组织，且淋巴结转移组E-cadherin表达明显低于无淋巴结转移组，提示E-cadherin参与了食管癌细胞浸润及转移的过程［8］。本实验结果与上述研究结果基本一致，E-cadherin在正常食管鳞状上皮组织中呈高表达，而在大部分ESCC组织中表达显著下调，其表达强度在不同肿瘤分化程度、浸润深度、TNM分期及淋巴结转移情况间的差异有统计学意义，且E-cadherin低表达是影响ESCC患者预后的独立危险因素之一，提示其在肿瘤发生、发展和转移过程中起着重要作用，并可影响患者预后。

FOXQ1和E-cadherin促进肿瘤细胞侵袭与转移可能的机制如下：（1）FOXQ1基因的表达上调能促进上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transi⁃tion，EMT），EMT中最具代表性的变化就是E-cad⁃herin减少，而FOXQ1基因促进肿瘤侵袭的分子机制正是通过其能特异性地结合到E-cadherin核心启动子区的E-box从而抑制其表达［2］。（2）E-cad⁃herin减少造成细胞间附着能力的下降，同时亦造成E-钙黏蛋白复合物（E-cadherin complex）的降解，使β-链蛋白（β-catenin）进入细胞核的概率上升，导致β-catenin在细胞质内聚集，进而激活β-catenin所介导的WNT信号通路，最终导致肿瘤的发生发展与转移［9-10］。Feng等［5］研究发现在肺癌中FOXQ1基因表达上调，E-cadherin表达下调，推测FOXQ1基因通过调控E-cadherin，使其表达下调，引起肺上皮细胞发生EMT，导致肺癌的发生和发展。Christensen等［11］研究发现原发肿瘤中FOXQ1基因表达与WNT信号通路的激活密切相关，考虑FOXQ1可作为WNT信号通路的激活的一个标记。本研究结果表明，ESCC组织中FOXQ1与E-cadherin的表达呈负相关，考虑可能是由于FOXQ1表达的增加，通过与E-cadherin核心启动子区的E-box结合抑制E-cad⁃herin的表达，使细胞黏附力下降，造成细胞容易分散而向外周浸润性生长，最终导致ESCC的发生发展乃至于转移，但具体机制还有待进一步研究。联合检测二者的表达可作为判断食管鳞癌患者其预后的参考指标之一，也可能为食管癌治疗提供新的治疗靶点。

（图1～4见插页）

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（2014-08-18收稿2014-10-16修回）

（本文编辑陈丽洁）

Expression levels and clinical significance of FOXQ1 and E-cadherin in esophageal squamous cell carcinoma

YU Haifeng1，ZHANG Xun2△，XU Meilin3，WANG Jing3，LU Xike2
1 Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Thoracic Surgery，Tianjin Chest Hospital；3 Department of Pathology，Tianjin Chest Hospital
△Corresponding AuthorE-mail:zhangxun69@163.com

ObjectiveTo investigate the expression levels and clinical significance of（forkhead box Q1）FOXQ1 and E-cadherin in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）.MethodsExpression levels of FOXQ1 and E-cadherin were in ESCC tissues（ESCC group，n=42）and adjacent normal esophageal tissues（control group，n=42）were detected using im⁃munohistochemistry.Correlations of FOXQ1 and E-cadherin expressions with clinical pathological parameters and progno⁃sis were analyzed between two groups.ResultsThe expression level of FOXQ1 was significantly higher in ESCC group than that in control group（64.29%vs 28.57%，χ2=5.384，P＜0.05）.The expression level of E-cadherin was significantly lower in ESCC group than that incontrol group（52.38%vs 90.48%，χ2=7.691，P＜0.05）.There were significant differences in FOXQ1 expressions between different TNM stages and whether lymph node metastasis is involved within ESCC group. There were significant differences in expression of E-cadherin between different tumor differentiation，depth of invasion，TNM stage and whether lymph node metastasis is involved within ESCC group.The expression of FOXQ1 was negatively cor⁃related with E-cadherin in ESCC（r=-0.412，P＜0.05）.The 5-year survival rates were significantly lower with high expres⁃sion of FOXQ1 or with low expression of FOXQ1（18.52%vs 66.67%，χ2=9.737，P＜0.05）.The 5-year survival rates were significantly higher with high expression of E-cadherinor low expression of E-cadherin（59.09%vs 10.00%，χ2=10.996，P＜0.05）.A multivariate Cox's proportional hazard regression analysis indicated that high FOXQ1 expression，low E-cadherin expression and lymph node metastasis were independent prognostic factors for ESCC.ConclusionThe expression of FOXQ1 and E-cadherin showed a good correlation with ESCC.And examining expressions of both FOXQ1 and E-cadherin in ESCC may have practical values in estimating the prognosis of ESCC and directing future treatment.

esophageal neoplasms；carcinoma，squamous cell；cadherins；prognosis；immunohistochemistry；forkhead box Q1；E-cadherin

R735.1

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.015

1天津医科大学研究生院（邮编300070）；2天津市胸科医院胸外科，3病理科

于海峰（1987），男，硕士在读，主要从事食管癌临床及基础研究

△E-mail:zhangxun69@163.com