黄药子醇提物抑制胃癌细胞功能的研究

王磊磊，王丹丹，陈贯虹，孔学，郑立稳，王加宁△

黄药子醇提物抑制胃癌细胞功能的研究

王磊磊1，王丹丹2，陈贯虹1，孔学1，郑立稳1，王加宁1△

目的研究黄药子醇提物对人胃癌细胞增殖、克隆形成和迁移能力的影响。方法制备黄药子醇提物，根据细胞培养液所含黄药子醇提物的不同浓度，将实验分为黄药子醇提物高浓度组（120 mg/L）、低浓度组（60 mg/L）和对照组（等量无菌水）。通过体外MTT、克隆形成实验、细胞迁移实验，分别检测黄药子醇提物对人胃癌细胞系MGC803增殖、克隆形成和迁移能力的影响。结果与对照组相比，黄药子醇提物高浓度组和低浓度组胃癌细胞体外增殖速度明显减慢（培养第2～6天时，F分别为29.130、21.864、67.826、36.015、43.656，均P＜0.01）、平板克隆形成率明显减少（F=11.918，P＜0.01），黄药子醇提物高浓度组的细胞迁移能力明显降低（F=4.258，P＜0.05）。结论黄药子醇提物可以显著抑制胃癌细胞增殖、克隆形成和迁移能力，具有潜在的抑制胃癌细胞转移的能力。

黄药子；胃肿瘤；细胞增殖；集落形成单位测定；细胞迁移分析

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，位居所有肿瘤致死率的第二位［1］。由于早期胃癌临床症状不明显，大部分患者就诊时已处于中晚期，多数丧失了根治切除的机会［2］。目前，药物治疗是晚期胃癌治疗的主要手段。中药黄药子为薯蓣科植物黄独的块茎，具有化痰散结、消瘿化瘤、凉血止血、抗癌等功效［3］，是当今治疗癌症的主要中药之一。现代《中药大辞典》记述黄药子对甲状腺肿瘤、食道癌、胃癌等均具有抗癌作用，但其治疗胃癌的疗效和药理作用尚不明确［4］。本研究主要检测了黄药子醇提物对胃癌细胞系增殖、克隆形成及迁移能力的影响，为黄药子治疗胃癌的临床应用提供理论依据，同时为阐明黄药子治疗胃癌的药理作用提供线索。

1　材料与方法

1.1实验材料胃癌细胞系MGC803由中山大学肿瘤防治中心提供。黄药子（批号120512）购自济南市漱玉平民大药房。RPMI-1640培养基（Gibco公司）。胎牛血清（NBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司。CellTiter 96®细胞增殖检测试剂盒（美国Promega）。牛血清白蛋白（BSA）购自广州威佳科技有限公司。

1.2主要仪器超净工作台（上海整新电子设备厂），371型二氧化碳培养箱（赛默飞世尔科技有限公司），酶标仪（南京欧熙科贸有限公司），GB303基本型电子天平（Mettler-Totado公司），ECLIPS 80i光学显微镜（日本尼康公司），CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司），SORVALL LEGEND离心机（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1黄药子醇提物的制备将黄药子药材粉碎后，水煎过滤，离心后取上清液浓缩，加入乙醇渗漏提取，过滤后离心，上清液旋转蒸发至干，称质量，并用蒸馏水定容（1 g/mL提取物），115℃高压灭菌15 min，冷冻保存备用，用于考察黄药子醇提物对胃癌细胞功能的影响。

1.3.2细胞培养及实验分组胃癌细胞MGC803用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液培养，内含100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素。实验分别设黄药子醇提物低浓度组、高浓度组和对照组，其中低、高浓度组黄药子醇提物浓度分别为60和120 mg/L，对照组加入等量的无菌水。将各组细胞放于37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3.3胃癌细胞增殖的检测（MTT比色实验） 参考文献［5］方法，将对数生长期胃癌细胞消化重悬，调整浓度至2 500 个/mL，接种于96孔板，每孔200 μL，每组每天5个重复。贴壁培养12 h后，于第1天向细胞内加入20 μL Cell Titer 96®AQueous One Solution Reagent，37℃5%CO2的培养箱培养2 h。空白对照为200 μL不含细胞的培养基，直接加入20 μL Cell Titer 96®AQueous One Solution Reagent。用酶标仪于490 nm读取吸光度值（A490）。重复上述操作，每24 h重复测定1次，连续测定6 d，统计分析并绘制胃癌细胞增殖曲线。

1.3.4胃癌细胞平板克隆形成实验参考文献［6］方法，收集传代的胃癌细胞悬液，调整浓度至250个细胞/mL，接种于6孔培养板，每孔2 mL，充分混匀，分别加入不同浓度的黄药子醇提物，常规培养10 d，每组3个重复。期间每隔3 d更换新鲜培养液继续培养。倒尽培养基，生理盐水洗涤2遍，空气干燥后75%乙醇固定15 min，0.5%结晶紫染色2 h，清水洗净干燥。显微镜下观察拍照，计数形成的克隆（≥50个细胞为1个克隆）。平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数× 100%。细胞克隆形成实验进行3次生物学重复，并统计分析。

1.3.5胃癌细胞体外迁移实验取对数生长期胃癌细胞，用无血清RPMI 1640培养基重悬，调整浓度至1×105个细胞/ mL。在Corning Costar transwell培养小室上层接种200 μL细胞，上层培养液含0.05%的牛血清白蛋白。下层加入500 μL RPMI 1640培养基，分别加入不同浓度的黄药子醇提物，每组3个复孔，37℃5%CO2培养48 h。取出小室，用棉签轻轻擦净小室内的细胞，75%乙醇固定30 min，3%结晶紫染色30 min，洗净后于光学显微镜下观察。于400倍下随机读取上、下、左、右、中心共5个视野计数穿膜细胞，取各视野的均数表示胃癌细胞的体外迁移能力。

1.4统计学方法实验采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料采用±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1黄药子醇提物对胃癌细胞增殖的影响培养第1天时，各组细胞增殖率差异无统计学意义，培养第2～6天时，黄药子醇提物高浓度组和低浓度组细胞增殖能力较对照组显著减慢（P＜0.01），见表1。

Tab.1　Alcohol extract from Dioscore bulbifera inhibit MGC803 cells proliferation shown by MTT assay表1　各组吸光度值比较　（n=5，A490，±s）

Tab.1　Alcohol extract from Dioscore bulbifera inhibit MGC803 cells proliferation shown by MTT assay表1　各组吸光度值比较　（n=5，A490，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a与对照组比较，b与低浓度组比较，P＜0.05

组别对照组低浓度组高浓度组F 第1天0.106±0.028 0.091±0.009 0.085±0.018 1.417 第2天0.461±0.090 0.323±0.027a0.181±0.035ab29.130＊＊第3天0.648±0.062 0.493±0.077a0.381±0.050ab21.864＊＊组别对照组低浓度组高浓度组F 第4天1.156±0.086 0.604±0.127a0.504±0.061a67.826＊＊第5天1.352±0.095 0.968±0.161a0.732±0.078ab36.015＊＊第6天1.925±0.205 1.285±0.130a0.899±0.183ab43.656＊＊

2.2黄药子醇提物对胃癌细胞克隆形成能力的影响黄药子醇提物高浓度组和低浓度组的平板克隆形成数量明显少于对照组，见图1。与对照组相比，黄药子醇提物高浓度组和低浓度组平板克隆形成率明显降低（F=11.918，P＜0.01），见图2。

2.3黄药子醇提物对胃癌细胞迁移能力的影响黄药子醇提物高浓度组和低浓度组的胃癌细胞迁移数量明显少于对照组，见图3。与对照组相比，黄药子醇提物高浓度组的胃癌细胞迁移能力明显减弱（F=4.258，P＜0.05），见图4。

3　讨论

3.1黄药子在临床抗肿瘤中的应用黄药子是治疗多种肿瘤的传统中药，具有化痰散结、消瘿化瘤、清热解毒、凉血止血等功效，其抑瘤活性成分主要包括黄药子素A、B、C以及薯蓣皂苷等［7］。目前，临床常用黄独单、复方、黄独注射液、复方黄独注射液、黄独药酒、复方黄独片、复方黄独丸等制剂治疗多种恶性肿瘤，包括消化道癌症、肺癌、甲状腺癌、子宫肌瘤等［7］。由于黄药子在临床使用过程中的不良反应，大大限制了黄药子特有疗效的发挥。目前，对于黄药子的有效成分及毒性成分尚不能完全确定，而且，不同极性溶剂对黄药子提取后的药理和毒理学作用也不尽相同［8］。黄药子水提物的不良反应尤其是肝毒性屡有报道［8］。有研究发现黄药子醚提取物和醇提取物均具有抑制肿瘤腹水形成的作用［9］。由于醇提取方式具有杂质少、提取率高等优点，对于成分的分离更为有利，本研究采用醇提取方式提纯黄药子，检测其对胃癌细胞一系列生物学功能的影响，探讨黄药子醇提物对胃癌细胞功能的作用。

Fig.2　Alcohol extract from Dioscore bulbifera inhibit colony formation of MGC803 cells图2　黄药子醇提物对胃癌细胞平板克隆形成率的影响

Fig.4　Alcohol extract of Dioscore bulbifera inhibit migration of MGC803 cells图4　黄药子醇提物对胃癌细胞迁移的影响

3.2黄药子抗肿瘤作用研究近年来，黄药子抗肿瘤作用的研究较多。Wang等［10］通过检测黄药子不同提取物的抗肿瘤活性，结果表明醇提物能够抑制荷瘤鼠肉瘤细胞S180和肝癌细胞H22的瘤体质量。黄药子乙素可诱导人早幼粒白血病细胞HL-60和人表皮癌细胞A431等凋亡［7］。黄独油对子宫颈癌（U14）有一定的抑制作用［7］。赵艳等［11］通过观察黄药子对人甲状腺癌细胞株SW579凋亡抑制蛋白（Survivin）的影响，结果显示药物组细胞Survivin的表达明显低于空白对照组，提示黄药子能明显下调Survivin的表达，诱导甲状腺癌细胞凋亡。

黄药子对胃癌细胞功能的影响及其治疗胃癌的药理作用研究较少。本实验结果表明，与对照组相比，经黄药子醇提物处理后的胃癌细胞的体外增殖速度明显减慢，平板克隆形成率明显降低，这些结果表明黄药子醇提物可以显著抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成能力。同时，黄药子醇提物处理后的胃癌细胞体外迁移能力明显减弱，表明黄药子具有潜在的抑制胃癌细胞转移的能力。此外，高浓度组的胃癌细胞增殖速度明显低于低浓度组，表明增高黄药子浓度对胃癌细胞增殖能力的抑制作用增强。

3.3黄药子抗肿瘤的分子机制研究目前，关于黄药子抑制肿瘤的分子机制研究较少。索晴等［12］通过黄药子及黄药子配伍当归后醇提物的抗肿瘤作用研究表明，黄药子配伍当归后可能通过降低ATP依赖性跨膜转运蛋白（P-gp）的表达来加强黄药子的抗肿瘤作用。陈翔等［8］研究表明黄药子醇提物对裸鼠胃癌移植瘤模型有明显的抑瘤作用，其作用机制可能与下调细胞因子白细胞介素8（IL-8）和细胞间黏附分子-1（sICAM-1）的表达有关。关于黄药子抑制胃癌细胞功能的分子机制了解较少，有待于进一步的深入研究。

（图1、3见插页）

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（2014-07-11收稿2014-10-20修回）

（本文编辑李鹏）

Inhibiting effect of alcohol extract from Dioscore bulbifera on gastric cancer cells

WANG Leilei1，WANG Dandan2，CHEN Guanhong1，KONG Xue1，ZHENG Liwen1，WANG Jianing1△
1 Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China；2 Shandong Academy of Medical Sciences，Shandong Medicinal Biotechnology Centre
△Corresponding Author E-mail：wangjn@sdas.org

ObjectiveTo investigate the inhibiting effects of alcohol extract from Dioscore bulbifera on proliferation，colony formation and migration of cancer cell lines.MethodsAlcohol extract from Dioscore bulbifera was prepared using Soxhlet extraction.Human gastric cancer cell line MGC803 was treated with different concentrations（0，60，120 mg/L）of al⁃cohol extract from Dioscore bulbifera.In vitro，proliferation，colony formation and migration of gastric cancer cells were detect⁃ed by MTT，colony formation experiments and Transwell assay respectively.ResultsThe proliferation（day2-day 6，F= 29.130，21.864，67.826，36.015，43.656，P＜0.01）and colony formation（F=11.918，P＜0.01）of gastric cancer cells were significantly inhibited by administration of alcohol extract from Dioscore bulbifera at both 60 mg/L and 120 mg/L.The migra⁃tion（F=4.258，P＜0.05）of gastric cancer cells were significantly suppressed after cells were treated with120 mg/L alcohol ex⁃tract from Dioscore bulbifera.ConclusionAlcohol extract from Dioscore bulbifera significantly inhibit proliferation，colony formation and migration of gastric cancer cells.

Dioscore bulbifera；stomach neoplasms；cell proliferation；colony-forming units assay；cell migration assay

R735.2

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.006

国家科技支撑计划项目（2011BAE06B04）

1山东济南，山东省科学院生物研究所（邮编250014）；2山东省医学科学院，山东省医药生物技术研究中心

王磊（1986），男，助理研究员，博士，主要从事药物设计与有机合成研究

△E-mail：wangjn@sdas.org