桑青枯雷尔氏菌MR111的GspF基因的获取与结构分析

杨金宏

摘要：GspF是细菌Ⅱ型分泌系统的内膜平台的重要蛋白，利用PCR扩增技术，获得了桑青枯雷尔氏菌MR111的含有该类基因功能性结构域的GspF基因。NCBI在线BLASTP分析发现，该基因与雷尔氏菌属来源的同源基因的一致性在90%以上；在聚类分析中，首先所有雷尔氏菌属同源基因聚合在同一分支，后与皮氏罗尔斯顿菌的同源基因聚合。基因结构分析表明，该基因有2个由α螺旋组成的具有高度相似性的、跨膜胞质结构域，揭示该基因可能参与细菌的跨膜分泌。

关键词：桑青枯雷尔氏菌；Ⅱ型分泌系统；GspF基因；结构分析

中图分类号：S888.71+1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0038-03

植物致病细菌Ⅱ型分泌系统（T2SS）是由12～15个分泌途径转膜蛋白（GSP）基因簇为中心组成的复合体，向细胞外分泌毒性因子、胞外酶、毒素等许多重要的蛋白质，通过2步将蛋白从细胞内转移到细胞外[1]。GspF、GspL、GspM、GspE等共同组成T2SS的内膜平台，组装其他分泌元件，控制分泌通道的开启[2]。GspF是内膜平台中具有重要作用、并具有广泛分布的胞质膜蛋白，Thomas等通过分析GspF的氨基酸序列，结合欧文氏杆菌（Erwinia carotovora）的GspF与BlaM融合试验证实GspF穿过内膜3次，其N末端和C末端分别位于细胞质和周质[3]。2007年Arts等进一步通过碱性磷酸酶融合试验证实了绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）中GspF的同源物的拓扑结构，证实了GspF是一个质膜蛋白[4]。2009年，Abendroth等对来自霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的EpsF（GspF的同源基因）的N末端的胞质结构域的晶体结构进行了解析，其由6个反向平行α螺旋组成。2个分子EpsF蛋白的N-末端结构域形成1个紧密的二聚体并具有保守的结合界面[5]。Peabody等对大量来自细菌的GspF基因序列的分析表明，所有基因类似，且其2个胞质结构域是内部重复序列[6]。

植物青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的是一种具有严重危害的土传性病害[7]，本研究以桑青枯雷尔氏菌为研究对象，获得了桑青枯雷尔式菌的GspF基因的序列，并分析了其结构特征，为进一步研究桑青枯雷尔氏菌Ⅱ型分泌系统的基因功能和泌出机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桑青枯雷尔氏菌MR111由陕西省蚕桑重点实验室分离培养并保存。细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）购自天根生化科技（北京）有限公司。dNTPs、EX Taq DNA聚合酶等为宝生物工程（大连）有限公司产品。培养桑青枯雷尔氏菌用的TTC固体培养基和SPA液体培养基等相关试剂均为分析纯，自行配制。

1.2 试验方法

1.2.1 桑青枯雷尔氏菌MR111的活化与培养 超低温冰箱取出保存的桑青枯雷尔氏菌，划线于高压灭菌的TTC培养基，于26 ℃恒温培养箱中培养过夜，活化菌株。挑取TTC培养基生长的单菌落于SPA培养基，继续置于26 ℃恒温振荡培养过夜。

1.2.2 桑青枯雷尔氏菌基因组DNA的提取与GspF基因的PCR扩增 收集培养过夜的桑青枯雷尔氏菌MR111，按细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取基因组DNA，并以此为模板，以设计的GspF基因的PCR扩增引物（F：5′-CGATATGCCAGCCTTCC-3′；R：5′-CGTGACCTGTTGT-TTGA-3′）进行PCR反应，由于Gsp基因簇的GC含量相对较高（约70%），扩增体系中同时加入5%二甲基亚砜（DMSO），扩增桑青枯雷尔氏菌的GspF基因。使用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，检测PCR扩增产物，并将PCR扩增产物送上海生工武汉测序部进行测序。

1.2.3 GspF基因序列的分析 NCBI在线BLAST比对桑青枯雷尔氏菌MR111的GspF基因序列[8]，结合Rost等的方法[9]，分析基因编码氨基酸的结构域，并下载其他同源基因序列，进行序列的比对和结构的分析。

2 结果与分析

2.1 桑青枯雷尔氏菌MR111的GspF基因序列的获取

以提取的桑青枯雷尔氏菌的基因组DNA为模板，GspF基因扩增引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果在1 000 bp上方获得单一扩增条带（图1）。回收该条带并进行测序，获得GspF基因121 bp 至终止密码子后49个碱基共1 138 bp的序列（GenBank登录号：KM115545）。

NCBI在线分析基因编码氨基酸，结果表明同其他基因一样，GspF编码的氨基酸有2个具有高度保守性的T2SF

（pfam00482）结构、GspF（TIGR02120）结构以及T2SS系统的组分GspF的典型结构PulF（COG1459）（图2）。

2.2 GspF基因的比对与聚类分析

NCBI在线BLASTP比对分析，GspF基因与其他来源青枯雷尔氏菌、皮氏罗尔斯顿氏菌（Ralstonia pickettii）等雷尔氏菌属（Ralstonia sp.）的其他菌株的同源区域的一致性在90%以上，与伯克氏菌属（Cupriavidus sp.）、伯克霍尔氏菌（Burkholderia sp.）等的相似性在均在80%以上。MEGA 5.0软件[10]构

建GspF基因的NJ系统发育树，结果如图3所示。所有青枯雷尔氏菌的GspF基因聚合后与雷尔氏菌属和罗尔斯顿氏菌的同源基因聚合在一起，而伯克霍尔氏菌单独位于树的最远分支，这与传统分类一致。

2.3 GspF基因结构的分析

V. cholerae的EpsF基因的胞质结构域已通过晶体结构进行解析，本研究结合BLAST比对和Rost等的方法[8-9]分析基因结构，结果2个基因的2个胞质结构域的相似性均在80%以上（图4-A、B），GspF的前后2个胞质结构域间的相似性也在50%以上（图4-C），基因的C端、N端都具有6个α螺旋，Met（171）、 Val（192）之间具有跨膜螺旋结构。这与Peabody等分析的2个胞质结构域是内部重复序列一致[6]。

3 讨论与结论

革兰氏阴性菌中，细菌的跨膜分泌蛋白占细胞总蛋白的20%，与细菌毒素分泌到胞、表达细胞表面的膜蛋白等生命活动有关[11]。目前已经在革兰氏阴性菌中发现7种蛋白分泌机制，其中Ⅱ型分泌系统在革兰氏阴性细菌中广泛存在，该分泌系统以转膜蛋白GSP基因簇为中心，突变会造成许多蛋白分泌的缺乏[12-13]。本研究获得的桑青枯雷尔氏菌的GspF是具有广泛分布的胞质膜蛋白，BLAST软件分析GspF（EspF）基因间具有高度的相似性，MR111的GspF基因与其他来源青枯雷尔氏菌、皮氏罗尔斯顿氏菌以及雷尔氏菌属的其他菌株的同源区域的一致性在90%以上。基于该基因进行聚类分析，所有雷尔氏菌属聚合后再与罗尔斯顿氏菌的同源基因聚合，伯克霍尔氏菌单独位于树的最远分支，说明GspF基因的进化与细菌的进化是一致的，没有经历基因的水平转移[14]。

作为组成T2SS内膜平台的蛋白之一，GspF基因存在于所有的T2SS分泌系统中[1，15]，V. cholerae的基因EspF的二级结构中存在6个反向平行螺旋，形成具有多个α螺旋构成的跨膜区，把疏水基团放在骨架外侧，而亲水基团位于螺旋内侧，与有疏水性的脂双层结构的细胞膜融合，实现穿过细胞膜的分泌[5]。EspF与GspF形成α螺旋的胞质结构域内的相似性在80%以上，GspF的2个胞质结构域也具有50%以上相似性，均体现了作为分泌系统的重要组成基因在基因序列和结构上的保守性。

本研究通过PCR技术获得了桑青枯雷尔式菌MR111的GspF基因，并分析了基因间的相似性和结构特征，为进一步研究该菌的分泌机制奠定了基础。〗

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