pH示差法测定茄子皮中花青苷条件的优化

张艳侠 徐超 张立华

摘要：为探讨pH示差法测定茄子皮中花青苷的含量，用酸性乙醇溶液从茄子皮中提取花青苷，确定提取液的最大吸收波长、pH值的变化及平衡时间，还做了精密度试验、回收试验。结果表明，茄子皮提取液的最大吸收波长为530 nm，pH值选定为1.0、4.5，反应平衡时间为90 min，测定结果的相对标准偏差为1.2%（n=6），加标回收率为9642%。该方法能有效消除溶液中杂质对测定结果的影响，可用于茄子皮中花青苷的定量分析。

关键词：茄子皮；花青苷；pH示差法；定量分析

中图分类号：TS201.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0338-02

花青素是具有2-苯基苯并吡喃阳离子结构的衍生物，是广泛存在于植物中的水溶性天然色素。自然条件下游离状态的花青素极少见，其A环3-、5-、7-碳位上的羟基以糖苷键与一些单糖结合形成花青苷，因结合糖基的种类、数量、结合位置不同，花青苷的种类有所不同[1]。花青苷具有抗氧化、消除自由基、降低血清胆固醇、抗变异、抗肿瘤、促进视网膜上视红素再合成等生理功能，因而花青苷被作为功能性食品添加剂，具有果香味、水溶性好、安全性高等优点，已被消费者普遍接受[2]。茄子（Solanum melongena L.）果皮多紫红色，含有丰富的花青苷，且稳定性好。我国茄子種植面积大，其皮为副产物，因此茄子皮色素是一种极具开发前景的天然食用色素[3]，但目前对于其含量的测定缺少统一标准。

花青苷的定量分析方法通常有：单一pH法、差减法、高效液相色谱法、pH示差法。其中单一pH法测定花青苷时准确度相对较低，当仅以含量作为指标的对比依据时，可选用单一pH法，操作简便；差减法在测定花青苷含量的过程中，由于干扰组分的吸光度受提取试剂的影响，从而使得理论测定总花青苷的浓度准确度降低[4]；高效液相色谱技术虽已广泛应用于菠萝、柑橘、桃、杏等果实中的糖、酸组分和含量的测定，并具备高效、高灵敏度、分析速度快、样品不被破坏、易回收等优点，且方法精密度高、重复性好，但在测定花青苷单体含量时，要对样品花青苷进行分离纯化，并需要花青苷单体标准品，而花青苷标准品的不稳定，或是不明确样品中的花青苷单体组成，使该方法的使用受到限制[5]。有人研究pH示差法测定葡萄[6]、桑椹[7]中花青苷含量，结果表明该法的准确度较高、重现性好，而且操作方法简便、设备仪器较低廉、便于推广。本试验进行pH示差法测定茄子皮中花青苷含量的方法学研究，以期为茄子皮乃至其他植物材料中花青苷的定量分析提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为在枣庄当地市场购买的新鲜成熟的茄子，品种为台湾红茄，用打皮刀削取茄子皮备用。

试验试剂：无水乙醇（天津市致远化学试剂有限公司）；浓盐酸、氢氧化钾（山东省莱阳市经济技术开发区精细化工厂）；乙酸钠（天津市福晨化学试剂厂）等。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

主要仪器有：UV-2000型紫外-可见分光光度计（尤尼科仪器有限公司）、电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）、pHS-2F型酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、RE52CS-1型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、KS-300EI型超声波清洗机（宁波海曙科生超声设备有限公司）。

1.3 技术路线

准备植物材料→花青苷的提取→最大吸收波长的测定→pH值的确定→反应平衡时间的确定→精密度试验→回收试验。

1.4 茄子皮中花青苷的浸提

准确称量5 g茄子皮，按照1 g ∶10 mL的料液比加入酸性乙醇溶液，在50 ℃下浸提30 min；将过滤的滤液重复浸提3～4次；合并滤液并定容至250 mL。

1.5 测定花青苷的最大吸收波长

用酸性乙醇溶液将茄子皮浸提液稀释至适当浓度，在400～600 nm可见波长范围内用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描，绘制吸收光谱曲线，并找出峰值。

1.6 pH值的选定

以溶液pH值为变量构建梯度试验，在已测得的最大吸收波长下测量茄子皮浸提液的吸光度。绘制pH值-吸光度（D）曲线，选择最适pH值，要求在选定的2个pH值左右变动时吸光度变化不大。

1.7 平衡时间

在选定的2个最适pH值条件下，每隔20 min测量1次样品的吸光度，观察溶液吸光度随时间的变化，确定溶液的反应平衡时间。

1.8 精密度试验

将浸提液静置至反应平衡后，在已测得的最适pH值及最大吸收波长下，测量花青苷的吸光度，平行测定6次。按照Fuleki等的经验公式计算茄子皮中的花青苷含量[8]：

X=ΔDVFM×1 000/（εm）。

式中：X为茄子皮中的花青苷含量，mg/g；ΔD为pH值为1.0、4.5时吸光度的差值；V为稀释体积，L；F为稀释倍数；M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数；m为样品质量，g。

1.9 回收试验

采用加入回收法，在试样中加入已知量的被测组分与等量的另1份相同的平行试样进行分析，求得加入的被测组分的回收率，根据回收率检查系统误差的大小。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长

取一定量的茄子皮浸提液，用酸性乙醇溶液稀释，在400～600 nm波长范围内进行可见光扫描，并绘制吸收光谱图曲线。由图1可知，在400～600 nm可见光谱范围内，浸提液中花青苷的吸光度变化表现为先增加后减小，即只存在唯一的峰值，可以看出，茄子皮中花青苷的最大吸收波长为530 nm。

2.2 pH值确定

为保证pH示差法有较高的的准确性和灵敏度，在选择pH值时应考虑以下3点：（1）所选择的2个pH值处所测得的花青苷吸光度差异应当是显著的；（2）单一pH值的变动，对花青苷的吸光度影响应是极小的；（3）花青苷在所处的2个最适pH值条件下，其结构应是相当稳定的。由于花青苷只在酸性介质中可以保持稳定，因而试验中只测定酸性介质中不同pH值条件下花青苷浸提液最大吸收波长处的吸光度变化，并以pH值为横坐标、吸光度D530 nm为纵坐标作图，详见图2。从图2可以得知，在pH值为0.8～ 1.5、4.0～ 5.0这2个区域内，pH值的轻微变动对吸光度的变化影响较小，并且在这2个pH值范围内，花青苷在酸性介质中具有相当的稳定性，满足试验要求。综上所述，选择的2个pH值分别为10、4.5。

2.3 反应平衡时间

花青苷在溶液介质中存在4种结构形式，这4种结构形式在某一pH值下处于动态平衡，当pH值改变时，动态平衡发生转移，总的趋势是pH值降低时，平衡向红色的2-苯基苯并吡喃阳离子移动；pH值升高时，平衡向蓝色醌式移动，并随时间的变化达到一个新的平衡。因此提取液用缓冲液稀释后，必须静置一段时间，等动态平衡处于稳定后，才能测定吸光度。试验中量取等量的浸提液，分别调其pH值至1.0、45，每隔20 min测量其吸光度，观察溶液吸光度随时间的变化，确定溶液平衡的时间，茄子皮花青苷在不同pH值溶液中的吸光度随时间的变化见表1。

由表1可知，在不同的缓冲溶液中随时间的变化，花青苷的吸光度不同。随时间的延长，在pH值为1.0的缓冲溶液中花青苷的吸光度基本稳定；在pH值为4.5的缓冲溶液中花青苷的吸光度随时间的延长而升高，90 min时处于稳定状态。因此，选择花青苷在缓冲液中的平衡时间为90 min。

2.4 精密度试验

按照“1.4”节的提取方法制得茄子皮花青苷浸提液 500 mL，从500 mL提取液中准确量取2份各25 mL的溶液，分别调节pH值至1.0、4.5，在波长530 nm处测定吸光度D530 nm，平行测定6次。按照相关公式计算样品中花青苷含量，结果（表2）可知，茄子皮中花青苷平均含量为0120 mg/g，相对标准偏差为1.20%。

2.5 回收试验

从上述茄子皮花青苷浸提液中准确量取2份100 mL溶液，分别标记为1、2，在50 ℃条件下真空干燥。将材料1溶解于100 mL 1.2 mol/L HCl-70%乙醇溶液中，用本研究的方法测定酸性乙醇中花青苷的含量，即为加标量。将材料2再溶解于100 mL浸提液中， 采用相同方法测定浸提液中加标后花青苷的含量。将材料2试验所测得的含量减去浸提液中原有花青苷含量，即为加标样的实际测得量。由测定结果、回收率（表3），可以看出，平均回收率为96.42%，其相对标准偏差为0.49%。

3 结论

本试验结果表明，茄子皮中花青苷的最大吸收波长为530 nm，与文献报道的花青苷最大吸收波长在520～540 nm之间的数据相符。而反应平衡时间由于受到温度、湿度、提取时间等因素的影响，会有较大的差别；根据相关研究可以看出，反应平衡时间选择在90～110 min对试验不会有影响。通过精密度试验结果得出，茄子皮中花青苷的含量为 0.120 mg/g，而根据加入回收法测得的平均回收率为9642%，其相对标准偏差为0.49%，可知溶液中其他因素对花青苷含量测定的影响极小，可以忽略不计。总之，采用pH示差法对茄子皮中花青苷的含量进行定量分析，能有效地消除溶液中其他有机杂质对测定结果的影响，可信度较高，为今后的茄子皮及其他植物果实中花青苷定量分析提供了一定的理论依据。

参考文献：

[1]李兴国，于泽源. 花青苷的研究进展[J]. 北方园艺，2003（4）：6-8.

[2]李传欣，张 华，李景琳. 食用天然色素的应用及发展趋势[J]. 辽宁农业科学，2001（1）：29-32.

[3]申爱民. 我国茄子生产概况及发展趋势[J]. 现代农业科技，2007（21）：64，67.

[4]霍琳琳，蘇 平，吕英华. 分光光度法测定桑葚总花色苷含量的研究[J]. 酿酒，2005，32（4）：88-89.

[5]孙婧超，刘玉田，赵玉平，等. pH示差法测定蓝莓酒中花色苷条件的优化[J]. 中国酿造，2011（11）：171-174.

[6]刘洪海，张晓丽，杜 平，等. pH示差法测定烟73葡萄中花青素含量[J]. 中国调味品，2009，34（4）：110-111，117.

[7]杨兆艳. pH示差法测定桑椹红色素中花青素含量的研究[J]. 食品科技，2007，32（4）：201-203.

[8]Fuleki T，Francis F J. Quantitative methods for anthocyanins：1. Extraction and determination of total anthocyanins in cranberries[J]. Journal of Food Science，1968，33（1）：72-77.