过表达谷氧还蛋白基因GRX5提高酿酒酵母乙酸耐性

方青，张明明，陈洪奇，熊亮，赵心清，白凤武,

（1 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116023；2 上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240）

引 言

清洁能源燃料乙醇是重要的石油替代品，具有良好的发展前景[1-2]。以来源丰富且廉价的纤维质农林废弃物为原料生产燃料乙醇，是国内外生物能源发展的重要方向。但是，木质纤维素原料在预处理过程中可产生对细胞生长和代谢具有毒性的副产物，包括弱酸类、醛类和酚类等[3-4]。此外，利用酵母生产有机酸、维生素、酵母粉等商业产品过程中也会产生弱酸，抑制目标产物的积累[5]。乙酸作为主要的毒性副产物之一，能引起细胞内环境的酸化，从而对酵母细胞的生长和代谢都具有较强的抑制作用[3,6]，其毒性不仅包括pKa依赖的阴离子抑制作用，其造成的低pH 对细胞也产生损伤[7]。虽然可通过提高pH 缓解乙酸对细胞的毒性，但对于大规模生产，大量使用碱液会影响生产的经济性，增加操作的复杂性[8]。国内外利用代谢分析和遗传育种，已经对乙酸耐性的分子机理进行了较为深入的研究，获得了耐性提高的酿酒酵母菌株[3,5-6,9]。

谷胱甘肽依赖的氧化还原酶（GRX5p）是谷氧还蛋白亚家族成员之一，位于线粒体基质内，由GRX5基因编码，参与Fe/S 中心的合成与装配[10]。有研究表明，酿酒酵母细胞中乙醇诱发的活性氧（ROS）的产生与Fe/S 中心簇合成与装配系统异常密切相关，在酿酒酵母细胞中敲除GRX5基因导致 ROS 含量明显增加[11]。GRX5p 能够响应过氧化氢及超氧化物的胁迫作用，在细胞抗氧化作用中发挥重要作用[10,12-13]。此外，有文献报道其能与全局转录因子SPT10p 结合，在转录水平中起到调控蛋白表达的作用，通过调控耐性相关蛋白的表达来提高酵母细胞的胁迫耐受性[14]。但是，GRX5过表达对酿酒酵母乙酸耐性的影响目前还不清楚。本课题组在前期蛋白组研究中发现，乙醇发酵过程中细胞活性较好的样品中GRX5p 的蛋白表达量较高，因此本文研究了过表达GRX5对酿酒酵母乙酸耐受性的影响，为进一步选育高效工业乙醇酵母提供了参考。

1 实验材料和方法

1.1 菌种

大肠杆菌DH5α，酿酒酵母模式菌株S288C（瑞典查尔姆斯理工大学Jens Nielsen 教授惠赠），工业酿酒酵母Sc4126，本实验室保存。

1.2 培养基

LB 培养基（g·L-1）：酵母粉5，胰蛋白胨 10，NaCl 10，pH 7.0；液体YPD 培养基（g·L-1）：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨 20；斜面培养基（g·L-1）：葡萄糖 30，酵母粉 4，蛋白胨 3，琼脂粉 20；种子培养基（g·L-1）：葡萄糖 30，酵母粉4，蛋白胨 3；发酵培养基（g·L-1）：葡萄糖 100，酵母粉 4，蛋白胨 3，乙酸 5；固体YPD 培养基（g·L-1）：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨 20，琼脂粉 20；乙酸耐性检测培养基（g·L-1）：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨 20，琼脂粉 20，乙酸 5。

1.3 过表达菌株构建

以酿酒酵母S288C 基因组为模板，通过PCR扩增获得目的基因，所用上游引物为GRX5-F(5′-CTCCCGGGATGTTTCTCCCAAAATTCAATC-3′)，下 游 引 物 为 GRX5-R (5′-CCTTAATTAATCAACGATCTTTGGTTTCTTCT-3′)。将所得目的基因片段与pHO 整合表达载体[15]连接后转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，利用氨苄抗性平板筛选转化子。将验证正确含有目的基因的质粒经NotⅠ酶切线性化后电转化到宿主酵母中，通过G418 抗生素筛选得到多个该目的基因过表达的阳性酿酒酵母重组菌株。挑取转化子单菌落富集培养后提取的基因组，利用引物GRX5-F 和G418-R（5′-AGCCGTTTCTGTAATGAAGGAG-3′）进 行PCR 初步验证。大肠杆菌转化子筛选和培养加入氨苄青霉素，终浓度为100 μg·ml-1；酵母菌转化子的筛选采用G418，终浓度为200 μg·ml-1(S288C 宿主) 或300 μg·ml-1（Sc4126 宿主）。

1.4 菌种活化、耐性检测及乙醇发酵

1.4.1 菌种活化 从斜面上接一环含有空载体的对照菌株HO-Sc4126 及含有目的基因的过表达菌株HO-GRX5-Sc4126 至种子培养基中，30℃，150 r·min-1过夜培养，至生长对数期时进行下一步实验。

1.4.2 重组菌株的耐性检测 在固体YPD 培养基灭菌后添加5 g·L-1乙酸，制备乙酸耐性检测平板。将菌株活化培养液的OD620调至一致（1.5～2.0），10 倍梯度稀释，取2 μl 点样于乙酸耐性检测平板，30℃培养2～4 d，在菌株充分生长后拍照，具体方法参见文献[16]。

1.4.3 乙酸胁迫下的乙醇发酵 发酵实验所用菌株为HO-Sc4126 对照菌株及其GRX5过表达菌株。发酵培养基在灭菌后添加终浓度为5 g·L-1的乙酸，比较空载体菌株和GRX5过表达菌株乙酸胁迫条件下的生长和乙醇发酵。发酵方法如下：菌株经活化后用种子培养基调OD620至一致（1.5～2.0），按10%（体积）接种量转接到含100 ml 发酵培养基的250 ml 摇瓶中，于30℃和150 r·min-1条件下进行发酵。发酵过程中每6～12 h 定时取样，测定乙醇产量、残糖及生物量，每批实验重复3 次，得到一致的结果。

1.5 分析方法

1.5.1 葡萄糖浓度、乙醇浓度、生物量及代谢物的测定 发酵过程中葡萄糖浓度、乙醇浓度和生物量均按照文献[2]进行测定。

乙醇得率（YE/CS）由式（1）计算

式中，[ethanol]max为发酵过程中最大乙醇浓度，[sugar]consumed为发酵所消耗的糖。

生物量得率(YB/CS) 用式（2）计算

式中，[biomass]max表示发酵过程积累的最大生物量(干重)。实验组的乙醇得率和生物量得率都以对照组的百分数表示。

乙醇生产强度（YE/T）为发酵过程中最高乙醇浓度与达到这一产值所需时间的比值。

比乙醇生成速率（P）用式（4）计算

式（4）中生物量biomass 为细胞干重。

代谢物测定选择3 个不同时期（对数期，静止期，衰亡期），其对应的不同时间如表1所示。

表1 不同时期对应的不同发酵时间Table 1 Different phase corresponds to different time

发酵液中的代谢物分析采用Waters 1525 高效液相色谱（Waters,MA,USA）系统，装配Aminex HPX-87H 有机酸分析柱（300 mm×7.8 mm,Hercules,Bio-Rad）和示差检测器(Waters 410)。进样量20 μl，流动相为0.005 mol·L-1的H2SO4溶液，流速0.5 ml·min-1，示差检测器温度50℃，柱温50℃。

1.5.2 遗传稳定性分析 将待测菌 HO-GRX5-Sc4126 在YPD 斜面上活化后，按文献方法分析其遗传稳定性[17]。

1.6 RNA 提取及实时定量分析

采用Sangon Biotech 试剂盒提取在1.4.3 中所述乙酸胁迫条件下发酵过程中重组菌 HO-GRX5-Sc4126 和对照菌HO-Sc4126 对数生长期细胞的总RNA，参照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒方法将提取的RNA反转录为cDNA；Real-Time PCR 参照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒方法进行，将所得数据进行基因相对表达量的分析。目的基因引物分别为rt-GRX5-F（5'-AAGACCCAGAGCTACGTGAAG-3'）和 rt-GRX5-R（5'-AAGACCCAGAGCTACGTGAAG-3'）；以管家基因ACT1作为内参，引物及序列分别为ACT1-F（5'-ACCATGTTCCCAGGTATTGC-3′）和ACT1-R (5′-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3′)。

2 实验结果与讨论

2.1 过表达GRX5 对酿酒酵母细胞乙酸耐性的影响

为了研究谷氧还蛋白基因的过表达是否能提高酿酒酵母细胞的乙酸耐受性，构建了GRX5基因过表达的重组菌株，提取重组酵母的基因组DNA经过PCR 验证，证实重组菌株构建成功（结果未显示）。遗传稳定性分析结果显示在无抗生素培养基传代5 次后，随机挑选的100 个单菌落中有97 个仍可在含抗生素的平板上正常生长，说明所得重组菌株遗传稳定性良好。同时比较了过表达GRX5菌株与对照菌株在5 g·L-1乙酸胁迫条件下的生长状况，结果见图1。

由图1(a) 可以看出，以工业酿酒酵母Sc4126为宿主的重组酿酒酵母HO-GRX5-Sc4126 菌株在含乙酸的平板上生长明显优于对照菌株，即在Sc4126宿主中过表达GRX5能显著提高其对5 g·L-1乙酸的耐受性。考虑到这种耐受性可能源于宿主遗传背景的影响，进一步研究了在模式酵母S288C 中过表达GRX5基因，发现在该宿主背景下，如图1(b) 所示过表达菌株较对照菌株亦具有更好的乙酸耐受性，证明GRX5的过表达提高乙酸耐性的表型可能适用于多种酿酒酵母。

图1 不同宿主中过表达GRX5 菌株与对照菌株在正常条件及5 g·L-1 乙酸胁迫条件下的生长状况Fig.1 Growth performance of GRX5 overexpression strain and control strain under 5 g·L-1 acetic acid stress condition and control condition (All experiments were carried out in triplicates and the same pattern was observed.Data from one representative experiment are shown)

2.2 乙酸胁迫条件下GRX5 表达水平分析及重组菌发酵性能与对照菌的比较

取乙酸胁迫条件下的重组菌和对照菌细胞进行实时定量PCR 分析，结果显示，重组菌株中GRX5基因的相对表达量是对照菌株的 1.87 倍（1.87±0.06，p＜0.001，n=3），表明GRX5基因的确在重组菌株中过表达。为了进一步验证重组菌株在胁迫条件下的发酵能力，实验测定了工业酿酒酵母Sc4126为宿主的重组酿酒酵母HO-GRX5-Sc4126菌株在5 g·L-1乙酸胁迫下的发酵性能。

2.2.1 过表达GRX5对乙酸胁迫下发酵性能的影响 乙酸胁迫条件下细胞生长和乙醇发酵结果如图2所示。在乙酸胁迫条件下，过表达GRX5的菌株最高OD620为3.30，而含空载体的对照组最高OD620为2.61，过表达菌株远高于对照菌株，在5 g·L-1乙酸胁迫条件下仍能维持较好的生长。过表达GRX5菌株在24 h 后开始进入对数期，而对照组则是在36 h 后才进入对数期，过表达菌株明显早于对照菌株，证明过表达GRX5能缩短乙酸胁迫条件下的停滞期[图2(a)]。

图2 HO-Sc4126 与HO-GRX5-Sc4126 菌株在5 g·L-1 乙酸下的生长状况、残糖及乙醇Fig.2 Cell growth,residual sugar and ethanol production of yeast strains under 5 g·L-1 acetic acid stress condition

残糖及乙醇数据如图2(b)，过表达菌株在48 h内基本消耗尽所有的葡萄糖，而对照组完全消耗则需要60 h，过表达GRX5菌株的发酵时间缩短了12 h。同时，过表达菌株的终点乙醇浓度高于对照菌株，分别为43.05 g·L-1和41.88 g·L-1，并且过表达菌株乙醇生成速率远快于对照菌株。可见，过表达GRX5缩短了该酿酒酵母在乙酸存在下的发酵周期，提高了其发酵性能。表2比较了不同菌株的乙醇发酵性能。重组菌株乙醇得率为0.431 g·g-1，相对于对照菌株的0.428 g·g-1，虽然并无显著差异，但其发酵时间为48 h，较对照菌株的60 h 缩短了12 h，乙醇生产强度达到0.897 g·L-1·h-1，明显高于对照菌株的0.698 g·L-1·h-1，提高了约28.5%。重组菌株的乙醇比生成速率为0.209 g·(g DCW)-1·h-1，对照菌株的乙醇比生成速率为0.206 g·(g DCW)-1·h-1，二者细胞发酵活性相当。

2.2.2 过表达GRX5对乙酸胁迫下发酵液中代谢物的影响 为了研究过表达GRX5基因对乙酸胁迫条件下的代谢物的影响，实验对发酵液中几种代谢物进行了测定，并根据生物量的变化选择了3 个不同时期进行比较。

图3(a) 为发酵液中海藻糖的比较。在不同时期，过表达GRX5的重组酿酒酵母菌株分泌的海藻糖均高于对照菌株，海藻糖本身具有保护细胞的作用，这可能与重组菌株较高的乙酸耐性有关[18]。图3(b)则显示无论是在静止期、对数期还是在衰亡期，过表达GRX5菌株较对照菌株而言，胞外琥珀酸浓度更高，这可能与其更强的TCA 循环作用相关，因为重组菌株需要通过补充更多的能量来应激5乙酸的胁迫作用。乳酸是厌氧条件下葡萄糖代谢的副产物，图3(c)为在不同时期发酵液中乳酸浓度，由该过表达菌株产生的乳酸在静止期与对数期均多于对照菌株，间接说明其在该5 g·L-1胁迫条件下代谢葡萄糖的能力强于对照菌株。过表达GRX5的重组菌株胞外甘油明显多于对照菌株，尤其是在对数期[图3(d)]。甘油和海藻糖都是细胞内重要的保护性物质[19-20]，其含量的提高与过表达GRX5的菌株具有更强乙酸耐性相符合。

表2 过表达GRX5 对乙醇得率、生物量得率以及乙醇生成速率的影响Table 2 Impact of GRX5 overexpression on ethanol yield,biomass yield and ethanol volumetric production rate of Sc4126 in presence of 5 g·L-1 acetic acid

图3 重组菌株与对照菌株在不同时期代谢物比较Fig.3 Extracellular metabolites of yeast strains in presence of 5 g·L-1 acetic acid in different growth phases

3 结 论

（1）过表达谷氧还蛋白基因GRX5能显著提高酿酒酵母细胞对乙酸的耐受性。

（2）过表达GRX5能缩短工业酿酒酵母Sc4126在乙酸胁迫条件下的发酵周期，提高其乙醇产率，从而提高其发酵性能。

（3）过表达GRX5的菌株在乙酸胁迫条件下的发酵过程中产生了更多的胁迫保护性物质。

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