土壤真菌多样性的分子生物学研究方法

时冬宁

(辽宁师范大学生命科学学院 辽宁大连 116081)

1 引言

土壤真菌(soil fungi)是指土壤中具有真核细胞的单细胞或多细胞分枝丝状体或单细胞个体。土壤真菌在环境中发挥着重要的作用。例如,许多土壤真菌是植物病原菌,对其研究有利于根除农业病害;还有一些土壤真菌与植物共生,它们对森林中植被的生存起着重要作用;此外,土壤真菌也是生态环境中的分解者,将动植物残体变成有用的碳源、氮源,重新被吸收利用,从而为生态平衡做出重要贡献。真菌与动植物一样,是一个独特的生物界,土壤真菌的研究受到越来越多的重视,保护真菌工作也逐渐开展起来。分子生物学方法是在分子水平上研究生命现象的科学。运用分子生物学方法研究土壤真菌,直接提取DNA,避免了传统的培养方法,弥补了传统方法分离率低的缺陷,能够分离出许多难培养的真菌,从而为丰富真菌资源,研究真菌分布,提供了有利的方法。

2 土壤真菌多样性的分子生物学研究方法

近年来兴起的分子生物学研究方法如:变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)、随机扩增多态性DNA技术(RAPD)、扩增片段长度多态性技术(AFLP)、限制性片段长度多态性技术(RFLP)、单链构象多态性技术(SSCP)、核糖体基因间区分析(RISA)、荧光原位杂交技术(FISH)、高通量技术等已经较为成熟,为土壤真菌的研究提供有效的保证[1]。本文主要介绍以下三种技术。

2.1 变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)

不同的DNA有不同的变性浓度,DGGE技术利用这一特点通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同,从而将序列不同的DNA分开。理论上DGGE技术能够将只存在单碱基差异的DNA分开。DGGE技术在研究土壤真菌的群落结构中发挥重要作用。它能够同时研究多个样品,分离优势菌群,操作简单,可重复。DGGE技术在土壤真菌的分子生态学研究中具有独特的优越性,已经成为一个快速分析土壤真菌群落结构的有力工具,为土壤真菌的深入研究提供依据。如Miao Wang等[2],运用DGGE方法研究环境改变对土壤真菌群落的影响,研究表明氮源增加显著改变了土壤真菌类群的组成。

2.2 高通量测序技术

高通量测序技术是分子生物学领域的一次重要变革。高通量测序技术一次能够测定几十万到几百万条的DNA分子序列。通过对大量序列的分析比对来研究土壤真菌的分布特点。高通量测序技术领域的发展,使得核酸序列的测定速度增加、测定成本下降。因此,高通量测序技术将不断的被大家采用和推广,必将拥有广阔的发展空间。Xiao-gang Li等[3],运用454焦磷酸测序技术,分析花生耕作地的土壤真菌,从18个土壤样品中获得194783条序列片段,通过分析表明花生产量下降与土壤中病原真菌的增加有关。

2.3 扩增片段长度多态性技术(AFLP)

AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。AFLP技术的优点是可靠性高,分辨率高、稳定性好、效率高,是目前一种被广泛应用的分子标记。用此技术研究土壤真菌能得到很好的效果。李潞滨等[4],对19株中国兰属植物菌根共生丝核菌进行了AFLP分析,结果表明兰花地理分布、所属种和生态类型是影响中国兰属植物菌根真菌多样性及其与兰花间专一性关系的关键因素。

3 前景

当今时代分子生物学已经应用到越来越多的领域,通过分子生物学方法研究真菌,不但直接的反应了真菌种类和类群的变化趋势,并且能够为土壤理化性质的变化提供依据,从而反应环境变化的趋势,为现在越来越受到重视的生态环境问题提供了有效的方法。但是如今分子生物学的研究还没有广泛的开展起来,随着分子生物学的进一步发展,将会进一步多层次,多角度的研究土壤真菌,从而为土壤真菌的进一步探索和发现提供强有力的技术支持。

[1]周桔,雷霆.土壤微生物多样性影响因素及研究方法的现状与展望[J].生物多样性,2007,15(3):306-311.

[2]Miao Wang,Shuai Shi,Fei Lin,Ping Jiang.Response of the soil fungal community to multi-factor environmental changes in a temperate forest[J].Applied Soil Ecology,81(2014)45-56.

[3]Xiao-gang Li,Chang-feng Ding,Tao-lin Zhang,Xing-xiang Wang.Fungal pathogen accumulation at the expense of plant-beneficial fungi as a consequence of consecutive peanut monoculturing[J].Soil Biology&Biochemistry,72(2014)11-18.

[4]李潞滨,胡陶,杨凯等.中国兰属植物菌根真菌的AFLP多样性分析[J].园艺学报,2008,35(l):81-86.