海洋贝类细胞培养技术及其应用

李建军，黄宝玉

（1.潍坊出入境检验检疫局，山东 潍坊 261041；2.中国科学院海洋研究所，山东 青岛 266071；3.中国科学院大学，北京 100049）

细胞培养技术是指在体外模拟体内细胞生长环境，置细胞于无菌，充足的营养条件，以及适宜的温度和酸碱度条件下，细胞能正常生长繁殖，并能维持结构和功能的一种技术。自从Harrison 于1907年以淋巴液做培养基进行蛙胚神经组织细胞的培养实验取得成功后，细胞培养技术经过一个多世纪的发展已日臻成熟，并成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。利用细胞培养的基础开展体外试验，已成为阐释生命机理，解释某些疾病的发病机制以及筛选药物的重要手段（薛庆善，2001）；另外，利用细胞培养与细胞融合（Cell fusion），转基因（Transgene） 技术相结合的手段可以进行基因重组、组织构建等。在产业上，利用细胞培养可以批量生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等，大大提高了效率并降低了成本（王捷，2004）。

目前，全世界已建立的细胞系至少有数千种，其中包括人和动物的正常细胞、肿瘤细胞以及遗传缺陷型细胞等。这也为低等动物细胞培养的研究提供了大量指导和参考。Grace等（1962） 实现了鳞翅目昆虫天蚕蛾（Antheraea eucalypti） 卵巢细胞系的建立（Grace，1962），开创了无脊椎动物病毒学、环境毒理学、遗传学和基因组学等研究领域（张博等，2011；艾庆辉等，2012）。然而，水生的无脊椎动物的细胞培养却面临重重困难。到目前为止，也仅建立了一种淡水蜗牛担轮幼虫胚胎（Biomphalaria glabrata embryonic，BGE） 细 胞 系（Hansen，1976）。迄今为止，在海洋无脊椎动物中尚未建立起成功的细胞系，目前的细胞培养多停留在原代培养和有限传代培养的水平。因此，建立海洋无脊椎动物的细胞系是当前国际上的攻关课题（郎刚华等，2000a）。鉴于最近我国近海污染比较严重，海洋贝类的重金属富集现象突出，海洋贝类食品安全问题日益明显。而海洋贝类细胞培养能为相关研究提供迅速灵敏的检测工具，应用前景广阔。此外，随着以长牡蛎全基因组序列的测序完成（Zhang et al，2012），以牡蛎为代表的海洋贝类功能基因的验证工作必将掀起前所未有的高潮。而相应的细胞系的建立能为基因功能验证提供强有力工具。现就贝类细胞的培养的意义及现状做一简要综述。

1 贝类细胞培养的研究意义

1.1 进行贝类基因功能验证

无论是高等的哺乳动物还是较为低等的水生无脊椎动物，基因功能的深入验证离不开相应细胞系的建立。无论是转染基因过表达蛋白还是基因的敲低，敲除，没有细胞系的成功建立，这些功能基因验证的常规实验都很难开展。细胞系的建立对功能基因验证的重要性在此也不再赘述。

1.2 在贝类免疫以及病害防治研究中的应用

贝类作为软体动物缺少获得性免疫，只能依靠自身的天然免疫系统来抵御外来的病菌等。近年来，经济贝类如牡蛎病毒病害相当严重，严重影响了水产养殖产业健康可持续的发展（Martenot et al，2010）。体外培养的细胞具有使病毒复制的全部条件，因此体外培养的细胞可以用于增殖甚至分离鉴定病毒，为贝类病毒学的理论研究以及后续抗病毒药物的开发提供理论指导。利用原代培养的血细胞与病原菌体外共培养的方法已经广泛应用于贝类免疫分子机制的研究（Qiu et al，2007；Yu et al，2012）。此外，多种螺类是人类寄生虫的中间宿主，相关的研究能为提高贝类食品安全提供保障，而体外细胞培养可为研究这些寄生虫与宿主的互作提供简便快捷的实验工具。

1.3 贝类珍珠形成机理研究

贝类珍珠的形成机制一直为人们所关注。目前对于分泌珍珠质的细胞生物学机制还了解不多，而基于个体或组织水平上的分析又有诸多不便，所以对于外套膜上皮细胞培养的研究对于珍珠产生机制的揭示具有重大意义。现代人工珍珠培养技术就是将供体珍珠贝外套膜组织块单独或与珠核一并植入受体珍珠贝体内形成无核珍珠或有核珍珠（王爱民等，2003）。那么能否模拟珍珠贝体内的环境，体外培养外套膜组织使之形成珍珠囊，最终在培养瓶中培育“试管珍珠”呢？这是长久以来人们的美好愿望，而愿望的实现首先要解决的问题就是珍珠贝体外细胞的培养。

1.4 应用于环境检测

海洋双壳贝类具有广泛的地域分布，也较易采集。固着、虑食的生活习性决定了贝类较容易在体内富集污染物，如牡蛎体内就能富集大量的重金属。因此贝类可作为净化水质和检测水污染的优选生物（Latire et al，2012）。由于贝类大部分是人们喜爱的肉质鲜美的食品，因此这也是关乎人类食品安全的大问题。如能建立起成功的贝类细胞系，那么这种分散的细胞相比动物个体来说具有操作简单、检测迅速准确以及灵敏度高等不可比拟的优点。因此细胞培养在环境检测方面以及相应的贝类食品安全等级评估等也显示出广泛的应用价值。

1.5 神经生物学的研究以及贝类肿瘤的研究等

神经生物学是21 世纪的明星学科。神经系统是异常复杂与精密的，所以其研究难度可想而知。软体动物拥有巨大的神经元，是研究神经生物学的难得的实验材料。并且由于其神经系统结构相对简单，比较容易鉴定和适于机械和一些电生理操作，所以神经细胞的培养已广泛用于神经轴突生长和再生的研究（Rinkevich，1999；Tamse，1995） 等。另外，贝类的细胞培养对于贝类肿瘤的研究等也具有重要意义。

2 贝类的细胞培养研究现状及应用

在无脊椎动物细胞培养的研究方面，海洋贝类的细胞培养在过去的半个世纪里研究最为广泛。虽然截至目前还没能培育出一个能无限传代成功的细胞系，但是海洋贝类的原代细胞的培养依然应用到了各个方面的研究。由于开展的研究较多，以下就海洋贝类不同组织的细胞培养做一简述。

2.1 血淋巴细胞培养

海洋无脊椎动物缺少获得性免疫系统，血液是重要的免疫器官。细胞培养作为良好的体外实验模型非常适用于血细胞对外毒物的反应的研究。Qiu等（2007） 利用原代培养的栉孔扇贝Chlamys farreri 血细胞探究了血细胞在细菌脂多糖LPS 刺激下免疫相关基因CfToll-1 表达量的变化情况。刘静等利用培养的栉孔扇贝血细胞筛选了细胞活性检测的方法，并且研究了苯并芘对栉孔扇贝血细胞的影响（刘静 等，2009）。Yu 等（2012） 利用多种病原相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMPs） 刺激培养的长牡蛎Crassostrea gigas 原代血细胞来研究相关基因表达随时间的变化情况。

2.2 鳃组织细胞培养

在国外，鳃组织细胞的培养在贻贝中研究的较多。国内的鳃细胞的研究在皱纹盘鲍，中国蛤蜊，菲律宾蛤仔，牡蛎中均有开展。李霞等（1997） 对皱纹盘鲍Haliotis.discus hanai 鳃组织细胞体外培养做了研究，用E-MEM 培养液成功将鳃细胞传代培养了10 代和11 代。崔龙波等（2000） 进行了皱纹盘鲍鳃细胞培养条件的摸索，并成功把其中两株鳃细胞分别传代培养了22 代和30 代。孙振兴等（2005） 将中国蛤蜊Mactra.chinensis 的鳃组织在RPMI1640 培养基中进行了原代培养。实验结果表明，在温度26 ℃～27 ℃，pH=7.4，培养基中不添加小牛血清的条件下，中国蛤蜊的组织也能正常生长。鳃组织培养24 小时后即有游离细胞从组织块迁出，最长培养时间可持续至第12 天。孙振兴等（2004） 还以菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum 的鳃组织为材料，分别用E-MEM 和M199 培养基对鳃细胞进行了原代培养。结果表明，两种培养基均满足菲律宾蛤仔鳃组织细胞培养的要求，细胞均能正常迁出和增殖（孙振兴 等，2004）。邓瑞鹏等（2004） 利用RPMI1640 培养基对僧帽牡蛎Saccostrea cucullata 的鳃组织进行了培养。并在此基础上研究了毒性较大的氯化三丁基锡对牡蛎鳃组织细胞的细胞形态以及存活率的影响。王彬等（2010）采用改良的DMEM 培养基成功的培养了近江牡蛎鳃组织的原代细胞。

2.3 外套膜细胞培养

王爱民等（1995） 经反复试验，筛选出适宜于马氏珠母贝Pinctada martensii 外套组织培养的平衡盐溶液（改进的MMBSS）、基本培养基，并且确立了防止污染的组织净化方法，并筛选出一种能促进细胞贴壁的物质。并在此基础上，用偏光显微镜、扫描电镜及X-射线能谱分析仪对所培养细胞的分泌物进行观察，为进一步探索体外珍珠提供了证据（王爱民等，2003）。

李霞等（1997） 用E-MEM 培养基成功将鲍外套膜细胞传至19 代。郎刚华等选用多种合成培养基与无机盐、小牛血清配合进行栉孔扇贝外套膜细胞的培养。通过反复实验发现以199 培养基为培养基的主要成分，添加各种盐以调整其渗透压和pH值，另外再加入20%小牛血清等成分为最佳（郎刚华等，2000b）。陈颉等（2007） 则采用改良的M199 培养基，研究文蛤Meretrix meretrix 外套膜细胞在不同温度和盐浓度条件下细胞的生长情况，他们培养的细胞可持续30～35 d。Gong 等（2008） 成功对对合浦珠母贝Pinctada fucata 的外套膜细胞进行了原代培养。并初步研究了其外表皮细胞参与生物矿化的壳基质蛋白分泌过程。他们的原代细胞培养基选用的是L-15 与M199 按1 ∶1 混合的培养基。并且添加了抗坏血酸，牛磺酸，乳白蛋白水解物及各类抗生素。在培养24 h 后细胞从组织块中迁出，流式细胞仪检测表明迁出的细胞处于G0/G1期的占83.8%，S 期的占14.61%，G2/M 期的仅1.59%，表明细胞蛋白合成非常活跃，但是几乎无增殖。

2.4 其他组织细胞的培养

除以上组织的原代细胞培养外，另外组织细胞的原代培养也有很多尝试。如心肌组织细胞，消化腺细胞，足肌细胞等。如Renault 等（1995） 对欧洲牡蛎Ostrea.edulis 心肌组织的细胞培养。他们从基本培养基、添加物、促贴壁物质等方面都进行了优化。结论是：心肌细胞最佳的培养条件为无菌海水（含3%L-15 培养基） 与长牡蛎C.gigas 血淋巴按1 ∶1 混合，同时添加10% Fetal Bovine Serum（FBS），促贴壁物质多聚赖氨酸等。You 等（2012） 则利用L-15 培养基添加酵母提取物的方法成功培养文蛤消化腺细胞，并在此基础上，成功开展RNA 干扰实验。足肌细胞的培养在皱纹盘鲍中有过尝试，但未能进行传代。Takeuchi 等（1998） 对地中海贻贝Mytilus galloprovincialis 的足细胞培养进行的比较成功，基础培养基L-15 中添加20%FBS 进行培养。经胶原酶处理获得的单细胞，4～7 d 便能形成单层，并且可进行传代；经胰酶消化后移至新培养瓶中的细胞可贴壁并增殖，7 d 内形成单层，研究还发现原代及传代细胞中的足丝蛋白Mgfp-1、Mgfp-2、Mgfp-3 基因可以稳定的进行转录。

还有其他关于海洋贝类原代细胞培养的尝试，在此就不一一列举。

3 贝类细胞培养面临的主要困难

3.1 培养基及促生长添加因子

对于贝类细胞的培养，基础培养基的选择应该不是难题，由以上的叙述可以看出，无论是EMEM，M199，还是L-15 或是M199 与L-15 培养基的混合液，细胞生长基础的营养应该都能供给。关键是在促生长的添加因子方面，一直没能寻得一种或是几种混合的生长因子来促进贝类细胞的生长繁殖。大量的已有研究成果表明，不能单纯的套用哺乳动物细胞培养模式，必须要充分的认识海洋贝类动物与哺乳动物的不同，深入研究贝类细胞的营养代谢以及细胞生理等，以便研发海洋贝类细胞培养所适用的培养基。像培养细胞小牛血清的利用，永生型BGE 细胞系的成功建立也表明，贝类细胞培养对小牛血清的依赖是不明确的，更有可能小牛血清中一些不确定的营养成分对贝类细胞的生长是有害的。对于不同的贝类，甚至是同种贝类不同组织的细胞，可能对营养以及生长因子的需求是不同的。这些都是需要明确并且亟待解决的问题。

3.2 污染防治问题

污染防治的问题一直是细胞培养面临的大问题。微生物污染是细胞培养过程中的大敌，其中以细菌、真菌和支原体污染最为常见。海洋贝类开放的生活环境，决定了其本身的器官组织有携带大量病菌的可能。虽然在自然条件下，贝类通过自身复杂精密的免疫调节娴熟的应对来自海洋的形形色色的侵扰，但是培养的细胞却失去了这种功能。通过怎样的手段或试剂来对组织进行彻底消毒，而又不影响海洋贝类细胞本身的活力成为困扰众多研究者的难题之一，有很大一部分的贝类细胞的培养终因污染而告终。另外，除以上细胞培养常见的污染之外，贝类细胞的培养还可能会受单细胞真核生物的污染，如阿米巴虫等（钟秀颖，2009），更增加了贝类细胞培养污染防治的难度。

3.3 细胞永生性转化问题

要建立一个成功的贝类细胞系，永生性是一个必须面对的问题。目前对于海洋无脊椎动物特别是贝类细胞增殖调控的知识知之甚少，分析其细胞周期和了解细胞分裂的分子机制将为永生性细胞的培养提供理论依据。近年来为了获得永生性的细胞系，转永生性相关基因技术、物理和化学诱变技术以及细胞杂交技术已有了初步的发展和应用，这也为解决海洋贝类细胞培养的永生性转化问题带来了新的希望。因此，寻找和深入挖掘海洋贝类的永生性转化相关基因，探究物理和化学方法诱变海洋贝类细胞的方法和条件，或是与其他永生性细胞杂交都是今后需要进一步开展的工作内容。

海洋贝类重要的经济和科研地位让越来越多的人为其细胞系的建立不断探索，多年来学者们对贝类细胞系的追求一直没有停止，也取得了相当多的成就，积累了丰富的经验资料等。但是由于各种问题的限制，海洋贝类细胞的培养现在仍然停留在原代细胞培养条件的摸索或如何使细胞在体外生存较长时间的阶段。如何在体外使贝类细胞无限增殖仍然是全世界所面临的难题。总之，要实现海洋贝类细胞建系的目标，首先要得到适合海洋贝类生长的合适的培养基，其次添加合适的生长因子等使细胞成功的进行传代，再次通过一系列的手段实现细胞的永生性转化，最终获得细胞系。海洋贝类细胞系的成功建立也必将为相关的分子生化研究以及提升海洋贝类食品安全等级提供保障。

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