鸡白痢沙门菌spiC::km 突变株减毒效应的病理学观察

耿士忠，安树敏，曾 玲，郭荣显，薛 颖，蒋远远，潘志明，焦新安

（扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州225009）

鸡白痢（Pullorum disease，PD）是由鸡白痢沙门菌（Salmonella Pullorum）引起的一种急性、全身性疾病，也是一种常见传染病，能引起雏鸡高发病率和高死亡率，是严重危害养鸡业的疾病之一，并造成严重经济损失。

目前，除了抗生素，沙门菌活疫苗被普遍认为是预防和治疗沙门菌病的有效手段。在前期研究中，我们发现spiC::km 突变株显著地降低了其致病性，除了能够激发体液免疫外，还能够引起细胞免疫和黏膜免疫，且细菌在体内只能短暂的生存，很快就被机体清除。此突变株具有沙门菌减毒活疫苗的特征和要求。本试验旨在从病理学角度观察spiC::km 突变株的致病性。

1 材料与方法

1.1 细菌对雏鸡的感染试验

1.1.1 细菌的准备 取新鲜培养的spiC::km 突变菌株及野生菌S06004 的单个菌落接种于LB 液体培养基中，37 ℃，180 min/r 摇振培养10 h，6 000 r/min 离心10 min，收集菌体，用PBS 洗涤细菌3 次，接种前用1%NaHCO3调节细菌至所需浓度，备用。

1.1.2 接种 将准备好的细菌口服接种1 日龄海蓝白雏鸡，并设立不同的浓度细菌接种组，分别109CFU/mL，108CFU/mL，107CFU/mL，每羽100 μL，5 只/组。设立野生菌S06004 感染阳性对照组与空白对照组。

1.2 病变观察

1.2.1 临床症状观察 接种细菌后，观察接种鸡的生长状况及外在表现，连续观察8 d，主要观察内容包括：a：精神不佳；b：嗜睡、羽毛蓬乱；c：腹泻（白痢）；d：死亡[1-2]。

1.2.2 病理组织学变化 观察接种后6 d 试验鸡的大体病变，采集试验鸡的十二指肠道、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、盲肠等脏器，以10%中性福尔马林溶液固定，按常规制备上述脏器的石蜡组织切片，H.E.染色，观察相应的病理变化[3]。

2 结果

2.1 临床症状观察 观察结果表明，spiC::km 突变菌株相比野生菌，几乎不能引起鸡明显的外在病理表现。在观察期内，野生菌S06004 都能导致典型的白痢腹泻症状，但随着剂量的增加，导致的死亡数也在相应地增加，即使没有死亡的鸡也表现出严重白痢腹泻。从体重上看，spiC::km 突变菌株对雏鸡生长没有影响，和空白对照组相比，略有增加；而野生菌S06004 作为阳性对照组，该菌则严重影响了雏鸡的生长，体重显著下降。

2.2 组织切片观察结果 野生菌S06004 组：肝脏淤血，脂肪变性，少量肝细胞凝固性坏死；肺脏也有淤血；十二指肠黏膜绒毛坏死脱落，坏死区的整个黏膜层浆膜充血；脾脏淋巴细胞数量减少；盲肠黏膜层坏死，黏膜下层充血。

spiC::km 突变菌株组：肝脏轻微脂肪变性；其它组织无明显病变，基本正常。

从结果中可明显看出，spiC::km 突变菌株引起雏鸡病理变化与正常对照相差不大，与野生菌相比症状显著减轻。进一步证明spiC::km 突变菌株相对野生菌毒力较弱（见中插彩版图1）。

空白对照组：无病理变化。

3 讨论

鸡白痢沙门菌在我国家禽养殖业中造成严重的危害[4]，主要是由于该沙门菌除了具有免疫逃逸及水平传播能力外，还具有垂直传播的能力，导致防疫困难。现行有效的防控对策是生物安全控制和净化措施，基本原则是淘汰感染鸡（群）。根据我国的国情，该措施实际实施难度大且代价昂贵。抗生素治疗虽有一定的效果，但不能完全阻止细菌感染，且长期使用抗生素已产生了多重耐药性和药物蓄积残留等诸多公共卫生问题[5]。为此，在我国及其他发展中国家迫切需要探索包括免疫预防在内的新的防控措施。

由于传统的灭活疫苗免疫效果不佳，免疫途径不方便而逐渐被淘汰。许多国家逐渐转向研究活疫苗来预防控制沙门菌病，并取得了很好的效果[6]，随着现代生物学和DNA 重组技术的发展，以及对沙门菌毒力遗传学的深入研究和了解，为在该病原体基因组中进行基因敲除制备等位基因突变体具备了可能性，这些突变体为研制沙门菌减毒活疫苗及基因功能研究提供了遗传学基础[7]。

我们根据鸡白痢沙门菌特有的生物学特性，运用转座突变的方法，发掘鸡白痢沙门菌具有减毒功能的基因决定簇。通过致病性的比较，鸡白痢沙门菌spiC::km 突变株具有显著的减毒效应，说明该基因灭活的鸡白痢沙门菌具有发展为减毒活疫苗的潜力。

spiC 基因是沙门菌2 型III 型分泌系统的蛋白之一，其功能已经被广泛研究[8]，但至今末有统一的结论，有待进一步探索。

[1] Wigley P，Hulme S D，Bumstead N，et al.In vivo and in vitro studies of genetic resistance to systemic salmonellosis in the chicken encoded by the SAL1 locus[J].Microbes Infect，2002，4：1111-1120.

[2] Shivaprasad H L.Fowl typhoid and pullorum disease[J].Rev Sci Tech，2000，19：405-424.

[3] 李和，周莉.组织化学与免疫组织化学[M].北京，人民卫生出版社，2008：9.

[4] 卢艳，刘蕾，刘文博，等.1 株可形成生物膜鸡白痢沙门菌的分离鉴定[J].中国兽医杂志，2010，46（9）：19-21.

[5] 焦新安，刘秀梵.禽沙门菌病流行现状与防制对策[J].中国禽业导刊，1998，15（1）：23-24.

[6] 朱其太.鸡沙门菌病的疫苗防治[J].中国家禽，2000，17（3）10.

[7] Fields P I，Swanson R V，Haidaris C G，et al.Mutants of Salmonella typhimurium that cannot survive within the macrophage are avirulent[J].Proceedings of the National Academy of Science USA，1986，83：5189-5193.

[8] Kuhle V，Hensel M.Cellular microbiology of intracellular Salmonella enterica：Functions of the type IIIsecrection system encoded by Salmonella pathogenicity island 2[J].Cell Mol Life Sci，2004，61：2812-2826.