gp100:209-217(210M)疫苗的研究进展①

周 帆 朱颐申 邹巧根 韦 萍 (南京工业大学生物与制药工程学院，南京 210009)

黑色素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤，具有高复发率和高死亡率的特点［1］，其5 年生存率低于10%，属于最难有效治疗的肿瘤之一［2］。由于黑色素瘤易发生转移，主要治疗方法为及早局部手术切除根治、晚期化疗和放疗等，但结果均不理想。近年来，随着分子生物学及基因工程技术的发展，利用多肽疫苗治疗黑色素瘤的方法受到广泛关注［3-6］。多肽疫苗通过启动人体自身的免疫功能对抗肿瘤细胞，不会破坏人体其他健康的生理组织，安全性高。gp100:209-217 (210 甲 硫 氨 酸，210Methionine，210M)是一种临床开发中的治疗性合成多肽疫苗，在针对黑色素瘤的临床试验中显示出积极功效，本文现对该疫苗综述如下。

1 gp100:209-217(210M)疫苗的免疫机制

多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测某段抗原表位的氨基酸序列，通过体外化学合成技术制备而得的多肽片段。与传统疫苗相比，多肽疫苗可以避免因疫苗毒力回升或灭活不全引起的安全问题，同时可以通过化学合成法高效大量制备。

gp100:209-217 是黑色素细胞蛋白第209 至217 位的多肽片段。黑色素瘤患者接种该多肽疫苗后，能够刺激并调节人体内白细胞抗原A2(Human leukocyte antigen A2，HLA-A2)限制性细胞毒素CD8+T 淋巴细胞的产生;T 淋巴细胞能够特异性识别表面带有gp100 蛋白抗原的黑色素瘤细胞，并分泌能穿透黑色素瘤细胞的酶，溶解gp100:209-217多肽针对的靶向细胞及黑色素瘤细胞株，使黑色素瘤细胞凋亡［7］。gp100:209-217(210M)，也称为g209-2M，是将gp100:209-217 位点210 处的苏氨酸置换为甲硫氨酸而制备得到的一种的治疗黑色素瘤的多肽疫苗［8］。与 gp100:209-217疫苗相比，gp100:209-217(210M)疫苗提高了与HLA-A2 的结合力，对T 淋巴细胞的免疫应答特异性及组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)分子的亲和力更强，对黑色素瘤患者的外周血单个核细胞体外的致敏性(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)效果更好，对恶性黑色素瘤细胞具有更强的免疫活性［9，10］。

2 gp100:209-217(210M)疫苗治疗恶性黑色素瘤的研究现状

2.1 体外试验 体外致敏性实验中，将gp100:209-217(210M)疫苗与黑色素瘤患者的PBMCs 直接接触，以酶联免疫吸附法(Enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA)测定PBMCs 释放γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)的生成量，以此作为评价疫苗免疫治疗黑色素瘤的性能指标(IFN-γ 主要由活化的T淋巴细胞分泌而来，辅助T 淋巴细胞识别肿瘤)。结果表明，未经疫苗免疫的PBMCs，不产生特异性活性;经gp100:209-217(210M)疫苗免疫的PBMCs，产生了针对HLA-A2+黑色素瘤的特异性活性，且具有高度的特异性［11］。

Liu 等［12］研究了gp100:209-217(210M)疫苗对体外诱导黑色素瘤患者PBMCs 中T 淋巴细胞增殖和表型的影响，联合使用疫苗和佐剂白介素-2(Interleukin-2，IL-2)、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)与黑色素瘤患者体中的PBMCs 接触。结果表明:疫苗与IL-7 联用不能显著诱导T 淋巴细胞的增殖、表型;疫苗与IL-2、IL-5 均可显著促进T 淋巴细胞的增殖和表型;联合使用IL-2、IL-5 和IL-7，其对T 淋巴细胞增殖和表型的刺激与单独使用IL-2 类似，从而说明联合使用gp100:209-217(210M)疫苗与IL-2，可有效提高对黑色素瘤的抗原能力，使黑色素瘤退化［13，14］。

2.2 动物试验 鉴于小鼠gp100:209-217 表位序列(ITDQVPFSV)与人类gp100:209-217 表位序列完全相同，Irvine 等［15］以HLA-A0201/H-2 Kb(A2/Kb)转基因小鼠为模型，将编码gp100:209-217(210M)的重组病毒感染机体，研究了其诱导反自CD8+T淋巴细胞对抑制肿瘤抗原gp100 活性的影响。结果表明:经210 位Met 锚定修饰后的免疫原促进了反自CD8+T 淋巴细胞与肿瘤靶细胞的脉冲结合活性，该反自CD8+T 淋巴细胞与野生型gp100:209-217 具有特异性，能够特异性识别小鼠黑色素瘤A2/Kb 表面的天然抗原表位(B16)，从而提高了重组病毒免疫原的抗原能力。

Tine 等［16］以HLA-A2.1 转基因HHD 小鼠为模型，研究了gp100:209-217(210M)疫苗对诱导细胞毒性T 淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte，CTL)的影响。CTL 是细胞在机体介导免疫的主要效应细胞之一，主要是产生对靶细胞的细胞毒效应，也分泌细胞因子参与免疫调节作用。结果表明:gp100:209-217(210M)疫苗在小鼠体内诱导产生了强烈的CTLs反应。

2.3 临床试验 Ⅰ期临床试验16 位恶性黑色素瘤患者(9 位男性，7 位女性，平均年龄49 岁)静脉注射gp100:209-217(210M)疫苗治疗黑色素瘤。患者每隔2 周注射一次疫苗，且剂量逐步上升。以毒性、临床和免疫反应率为首要指标，结果仅2 位患者出现了短暂的毒性反应，表明该多肽疫苗免疫治疗毒性反应低。随机分配10 位患者接受一周期治疗，6位患者接受两周期治疗。ELISA 分析结果显示:5位患者出现了针对gp100 的临床反应，其中4 位患者的临床情况稳定或出现肿瘤消退，从而表明该疫苗在黑色素瘤临床治疗方面发挥了积极作用［17］。

Powell 等［18］对5 位恶性黑色素瘤患者接种gp100:209-217(210M)，免疫佐剂为Montanide ISA 51。体外纵向PBMCs 分析显示多肽特异性CD8+T细胞产生了从早期效应到效应记忆性表型的转变。一年治疗期后，患者体内循环系统中的gp100:209-217(210M)特异性CD8+T 细胞从4.8% 上升至38.1%，并伴随出现了记忆性T 淋巴细胞，从而说明了注射gp100:209-217(210M)多肽疫苗对黑色素瘤具有免疫效应。

Tarhini 等［19］研究了联合使用gp100:209-217(210M)、MART-1:26-35 (27L)、酪氨酸酶:368-376(370D)以及佐剂PF-3512676 和GM-CSF 在治疗恶性黑色素瘤的安全性和免疫原性。结果表明:其安全性和免疫原性都较好。Ⅱ期临床试验［11］31 例转移性黑色素瘤患者服用高剂量IL-2 后，接种gp100:209-217(210M)疫苗及Montanide ISA-51(不完全弗氏佐剂)，其中13 例出现了临床反应(42%)，反应率显著高于单独使用IL-2 的反应率(15%～20%)［20］，为疫苗与IL-2 联用治疗黑色素瘤提供了依据［21-23］。

Schwartzentruber 等［24］对185 名患者进行了随机Ⅲ期临床试验。参与者为Ⅳ期或局灶晚期黑色素瘤、表达HLA-A 0201、无脑部转移、适合高剂量IL-2治疗的患者。患者被随机分为IL-2 单药治疗组(每剂量为720 000 U/kg)和联合治疗组，联合组用药方法为gp100:209-217(210M)加上每周期不完全弗氏佐剂(Montanide ISA-51)，然后使用IL-2。首要指标为临床反应率，次要指标包括毒性反应和无进展生存期。结果表明:联合治疗组的总体反应率比单药治疗组高(分别为16、6%，P=0.03)，无进展生存期较长(分别为2.2、1.6 月，P=0.008)，且平均总生存期也较长(分别为17.8、11.1 月，P=0.06)。因此，对于恶性黑色素瘤患者而言，使用疫苗和IL-2联合治疗比单独使用IL-2 治疗有更高的反应率和更长的无进展生存期。

3 提高gp100:209-217(210M)疫苗免疫活性的途径

肿瘤抗原往往不是单一表达，而是相关抗原的共同表达［25-27］。通常单一多肽抗原表位仅对一部分患者有效，原因在于人类中存在一些被通用MHCⅠ等位基因限制的多肽抗原表位(如HLA-A2，大约存在于40%的人类中)。为了保证疫苗在患者体中广泛发挥作用，其他CTL 抗原表位也必须被识别。因此联合采用2 种或多种抗原多肽可有效提高多肽疫苗对肿瘤细胞的杀伤力及其抗肿瘤逃逸的效应。

Levy 等［28］根据多表位多肽疫苗免疫治疗黑色素瘤(Multiepitope polypeptide for melanoma，MEPmel)的策略，设计了包含三个重复单元的四抗原表位［gp100:209-217(210M);gp100:280-288(288 缬氨酸，288valine，288V);Mart1:26-35(27 亮氨酸，27leucine，27L);酪氨酸酶:368-376(370 天冬氨酸，370aspartic acid，370D)］。多种多肽通过包含蛋白酶识别的基因序列相互关联，提高了蛋白解离和抗原表达的能力。结果表明:当用MEP-mel-转染的树突状细胞(DC)刺激多肽特异性T 淋巴细胞，会表达生成细胞因子IFN-γ。同时经MEP-mel-转染的DC表达的多肽具有蛋白酶依赖性，且比外源释放原生多肽的表达更持久。DC 负载MEP-mel 蛋白诱导弱交叉表达。因此，多表位多肽疫苗是提高gp100:209-217(210M)免疫疗法的策略之一，同时多种抗原多肽的联合使用扩大了其免疫原性，可应用于其他类型肿瘤的治疗［29，30］。

4 展望

综上所述，gp100:209-217(210M)多肽疫苗能够特异性主动免疫治疗黑色素瘤，其临床研究已取得一定进展。与其他类型的疫苗相比，gp100:209-217(210M)多肽疫苗因其合成简单、化学性质稳定、无毒力回升、无致癌性等优点，应用前景更为广泛［31］。随着对gp100:207-219(210M)多肽疫苗的进一步深入研究，不断优化多肽疫苗的设计方法，通过加强肿瘤微环境的免疫能力控制黑色素瘤细胞，如联合使用不同靶点的抗原多肽、结合适当载体、配伍新型佐剂、利用DC 负载多肽疫苗等方法，进一步改善其免疫原性，最大限度激发疫苗在抗肿瘤的免疫反应。

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