正交试验优选柴胡中黄酮类化合物提取工艺的研究

唐志国，王 斌，张腾霄

(1.绥化市食品药品检验检测所，黑龙江绥化 152061;2.绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化 152061)

中药柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.和狭叶柴胡B.scorzonerifolium Willd.的干燥根，前者习称北柴胡，后者习称南柴胡［1］。柴胡能散风退热、升阳疏肝，用于治疗感冒发热、寒热往来、痢疾、肝郁气滞、胸胁胀痛、子宫脱垂、脱肛、月经不调等症［2］。北柴胡主产于河北、河南、辽宁、陕西等。柴胡为常用大宗药材，其重要的药用价值使需求逐年增加，不仅国内需要量大，且大量出口。由于长期依赖采挖，野生资源及其生境破坏严重，资源已近枯竭，目前商品柴胡主要依赖栽培。柴胡存在严重的种内和种间类型混杂的现象，导致柴胡品种优劣不等的问题［3］。不同地区使用的药用部位也不尽相同，药典规定柴胡的药材为柴胡的根，但市场上的药材往往是根和5～10 cm茎的混品入药，有人则以地上部分入药。

柴胡中的有效成分为柴胡皂苷、甾醇、挥发油和多糖等，此外，还含有黄酮类成分。黄酮类化合物对人体在抗肿瘤、抗衰老及心血管等疾病的治疗和预防有重要意义［4－5］。如芦丁具有抗氧化、抗基因突变和降低毛细血管异常通透性及脆性的作用，临床上用于治疗过敏性紫癜及各种因毛细血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治疗高血压和老年气管炎等［6］。槲皮素是黄酮类化合物中具有代表性的一种，研究发现槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病并发症等多种生物活性及药理作用，对呼吸道疾病，特别是对哮喘病和支气管疾病有较好的作用［6－7］。目前国内关于柴胡提取工艺的文献报道较多，但多以皂苷类、挥发油指标进行考察，很少有单独考察黄酮类化合物的文献，因此，该研究采用正交试验考察柴胡中黄酮类化合物的提取及其不同部位的含量，为提高仿生栽培柴胡的质量和疗效打下基础。

1 材料与方法

1.1 仪器 Waters2695高效液相色谱仪(2996紫外检测器);KQ－500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司);METTLER AE240电子天平RE52－86A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药 仿生栽培样品采自黑龙江省的明水县柴胡种植基地，野生柴胡样品采自黑龙江省的明水县本地;芦丁(批号100080－200801)、槲皮素(批号 100081－200502)、山柰素(批号110861－200805)、异鼠李素(批号110860－200504)均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%;乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 柴胡中黄酮类化合物含量测定。

1.3.1.1 色谱条件。迪马 C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)－0.1%磷酸水(B)，梯度洗脱，0～15 min(5% ～20%A)、15～30 min(20% ～35%A)、30～45 min(35% ～45%A)、45～55 min(45% ～50%A)、55～60 min(50% ～5%A);洗脱时间为60 min;检测波长360 nm;流量1.0 ml/min;柱温为 35 ℃，进样量 20 μl。

1.3.1.2 标准曲线及线性范围。准确称取芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品各约20 mg，分别置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。混匀后分别进样 2、5、10、20、30 μl，按“1.3.1.1”色谱条件作HPLC分析。以峰面积对进样量进行回归处理，得芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素的线性回归方程和线性范围(表1)。

1.3.2 样品测定。精密吸取 20 μl样品溶液，在“1.3.1.1”色谱条件下测定，记录峰面积，分别计算相应黄酮类化合物的含量，再计算总量。

1.3.3 正交试验。以柴胡中4种黄酮类化合物含量的总量为指标，设定pH=7、浸渍时间30 min、提取时间20 min，分别以乙醇溶度、料液比、浸渍温度和超声功率等主要因素及不同水平进行L9(34)正交设计(表2)，筛选最佳工艺。

表1 4种黄酮标准曲线

表2 正交试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 正交试验结果 由表3可知，浸渍温度的极差Rj最大，其次是超声功率，故对黄酮类化合物提取效果的影响大小顺序是A＞D＞B＞C，即浸渍温度＞超声功率＞乙醇浓度＞料液比。由于料液比影响不显著，故综合考虑，选择最佳方案为A1B1C1D2，即5倍量的60%乙醇50℃浸渍，80 W功率超声提取20 min。

表3 正交试验结果

2.2 最佳方案的验证试验 取柴胡的根、茎和叶分别按最佳方案提取，重复2次。结果(表4)显示，此最佳工艺提取黄酮类化合物其含量较高，且工艺条件稳定可靠、重现性好。

表4 验证试验结果 %

3 讨论

(1)黄酮类化合物稳定性差，在较高温度下易分解氧化，因此提取时注意温度的控制。

(2)分析叶片和茎中黄酮类化合物的含量高于传统使用的根，刘秀芳等研究认为小叶黑柴胡茎叶中总黄酮具有很好的抗氧化活性［8］;詹雪晶等研究认为柴胡茎叶中总黄酮对四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝损伤有保护作用［9］。故很有必要对茎、叶进行进一步的研究，扩大柴胡用药部位。

［1］郑汉臣，蔡少青.药用植物学与生药学［M］.北京:人民卫生出版社，2003.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［3］ZHANG T T，ZHOU J，WANG Q.HPLC analysis of flavonoids fromthe aerial parts of Bupleurum species［J］.Chin J Nat Medi，2010，8(2):107 －113.

［4］ELISA T，MAURIZIO L G，SANTO G，et al.Cirus flavonoids molecularstructure，biological activity and nutritional properties:A review ［J］.Food Chemistry，2007，104(2):466 －479.

［5］CRISTINA I M，ALESSANDRA B，SARA V，et al.Flavonoid characterizationand in vitro antioxidant activity of Aconitum anthora L.(Ranunculaceae)［J］.Phytochemistry，2008，69(5):1220 －1226.

［6］岳志劲，关翠林，王海青，等.RP-HPLC法测定柴胡中四种黄酮类成分的含量［J］.山西大同大学学报:自然科学版，2010，26(4):35 －38.

［7］王艳芳，王新华，朱宇同.槲皮素药理作用研究进展［J］.天然产物研究与开发，2003，15(2):171 －173.

［8］刘秀芳，李婷婷，蔡光明，等.小叶黑柴胡茎叶总黄酮体外抗氧化活性的研究［J］.中南药学，2011，9(3):172 －175.

［9］詹雪晶，蔡霈，蔡光明，等.小叶黑柴胡茎叶总黄酮对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.中南药学，2011，9(4):241－243.