星点设计-效应面法（CCD-RSM）优选颈痛巴布剂提取工艺研究*

杨全伟，程 璐，马浩然，张 耕，谭静玲

（1.武汉市第一医院，湖北 武汉430022；2.湖北省食品药品监督检验研究院中药所，湖北 武汉430064）

颈痛巴布剂为武汉市中西医结合医院国家级重点专科针灸科张红星主任医师的临床处方，由《伤寒论》中葛根汤的基础上加减化裁而成，该方对神经根型颈椎病具有很好的疗效，用于治疗颈椎病，尤其是神经根型颈椎病，主要症见颈肩背强痛，颈部活动受限，常伴上肢放射性痛、麻木，甚则肌肉萎缩。本方为纯中药制剂，以前多与凡士林调和后涂敷与病患部位进行使用，经多年临床使用，副作用少、疗效确切。本研究在原组方不变的基础上，进行剂型改革，将传统膏药制剂制成具有良好的舒适性、渗透性好、使用方便，不污染衣物的巴布剂[1]。为了优选其最佳提取工艺条件，以方中君药葛根中有效成分葛根素的提取量和干膏提取率作为提取指标，采用HPLC 法测定处方中葛根素的含量，结合提取的干膏得率，以加水量、提取时间、提取次数分别设定其提取因素水平，以星点设计-效应面进行工艺，试验方法与结果报道如下。

1 仪器与试药

Waters e2695 高效液相色谱仪；赛多利斯ME215S 电子天平（Max210g d=0.01mg）；葛根素对照品（批号：110752-201110）；药材（葛根、芍药、防风、黄芪、桂枝、川芎、当归、炙甘草等10 味中药）（购于湖北天济医药有限公司）；甲醇为色谱纯，水为双重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 试验与结果

按处方比例称取药材137g，加水回流提取，收集所得药液，浓缩，加苯甲酸钠0.6g，调整全量至200mL，摇匀，装入棕色瓶中，密闭阴凉处保存备用。

2.1 实验仪器与材料[2]

色谱条件：色谱柱：依利特ODS HYPERSIC-C18柱（200mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-水（20∶80），流速：1.0mL/min，波长：250nm，柱温：25℃

2.2 溶液的制备

葛根素对照品溶液的制备：精密称取葛根素13.99mg，置于100mL 容量瓶中，加30%乙醇，制成每1mL 含0.139 9mg 的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备[3-4]：按处方比例称取药材137g，用8 倍量的水，回流提取2 次，每次提取1h，收集所得药液，浓缩至一定程度，加苯甲酸钠0.6g，调整全量至200mL，摇匀，作为实验样品；精密量取样品1mL，置50mL 容量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得。

葛根阴性溶液的制备：称取不含葛根的其余药材，用8 倍量的水，浸泡0.5h，回流提取2 次，每次提取1h，收集所得药液，浓缩至一定程度，加苯甲酸钠0.6g，调整全量至200mL，摇匀，按葛根供试品溶液制法即得。

2.3 方法

2.3.1 方法专属性

吸取对照品溶液、供试品、葛根阴性对照溶液各20μL，进样，检测，葛根素对照品、供试品、在18min 左右出现葛根素色谱峰，葛根阴性对照无干扰，见图1-3。

图1 对照品

图2 供试品

图3 阴性对照

表1 根痛合剂加样回收率试验结果

2.3.2 线性关系试验

取上述葛根素对照品溶液，分别在上述色谱条件下，分别进样2，4，8，12，16，20μL 注入高效液相色谱色谱中，测定峰面积，以峰面积、对照品浓度计算线性回归方程：Y=11143X-23229，r=0.9999；表明葛根素在0.2798～2.798μg 范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验

取上述对照品溶液，精密取10mL 至20mL 量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，进样20μL，连续进样6 次，记录葛根素峰面积RSD=1.02%，表明仪器的精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

取2.2 项下的溶液的制备项下供试品溶液中制备的实验样品，摇匀，精密量取1mL，置50mL 容量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得。分别于0，1，4，8，12，24h 进样20μL，测定峰面积，计算葛根素峰面积RSD=0.49%，表明供试品溶液在24h 内稳定。

2.3.5 重现性试验

取同一批2.2 项下的溶液的制备项下供试品溶液中制备的实验样品，按供试品溶液的制备方法平行制备6 份，测定葛根素的含量，计算结果平均含量为4.722mg·mL-1，RSD 值为0.83%，表明本法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

取已知含量样品1 份，摇匀，分别6 次精密量取1mL，置于6 个100mL 容量瓶中，各精密加入适量的葛根素对照品，加30%的乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得，分别进样20μL，测定并计算回收率，平均回收率为100.89%（RSD=0.96%），结果见下表1。

3 星点设计-效应面实验结果

在查阅文献基础上[5-8]，针对加水量，提取时间、提取次数3 个影响因素，分别设置3 个水平，以葛根素含量和干膏得率作为考察指标，采用星点设计-效应面进行工艺优选，结果见表2，表3。

3.1 模型拟合

根据实验结果，采用按照Design-Expert.V8.0.6.1 分别以葛根素含量为Y1，干膏得率Y2，对所选的2 个因素分别进行多元线性回归方程及二次多项式拟合，分别得回归方程为Y1=661.12+2.95X1-4.14X2+142.02X3（r=0.568 1，P=0.022 2）；Y2=30.60-1.21X1+0.55X2+3.39X3（r=0.786 5，P=0.000 5）。二项多项式方程为：Y1=807.49+2.95X1-4.14X2+142.02X3 -84.75X1X2 -25.01X1X3 +21.51X2X3 -106.59X12-80.04X22-87.80X32（r=0.972 1，P=0.002 3）；Y2 =31.39 -1.21X1 +0.55X2 +3.39X3 -1.28X1X2 +1.01X1X3-0.13X2X3+0.21X12-0.66X22-1.03X32（r=0.906 6，P=0.039 1）。

表2 星点设计因素水平

表3 星点设计及各指标试验结果

根据多元线性方程及二次多项式方程数据可以看出，各自的回归方程数据显示二项式方程的r值更接近1，P 值小于0.05. 故选择二项式模型为最终效应模型。

3.2 效应面优化与评估

根据模型拟合得到的二项式方程，采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件分别绘制各指标与因素的三维效应图和二维等高图，由图1 可知，葛根素含量（Y1）和干膏得率（Y2）随加水量、提取时间的增加而增加，然后到达顶点后再减少；随提取次数的增加而增加。葛根素的含量（Y1）由软件计算得最佳提取条件为加水量8.78 倍，提取3 次，每次提取1.87h；干膏得率（Y2）的最佳提取条件为加水量8.66 倍，提取3 次，每次提取1.82h；综合考虑，最终优选颈痛巴布剂处方最佳提取条件为加水8.7 倍，提取3 次，每次提取1.85h。见图4.

图4 葛根素含量（Y1）、干膏得率（Y2）对X2、X3 的三维效应图（A、C）和二维等高图（B、D）

4 优化验证

按照优选出的颈痛巴布剂处方的最佳提取条件，平行操作3 次，取其平均值与预测值进行比较，结果可知，实验值与预测值可以较好的描述其最佳提取关系，3 批验证结果葛根素含量及干膏得率较高，测定葛根药材的含量为47.296mg/g，计算3 批验证结果的平均转移率为56.64%，转移率较高，可以继续下一步的中试生产研究。验证结果见表4.

表4 验证结果

5 讨论

星点设计-效应面法可以弥补均匀设计和正交设计在实验中水平选择上的精确度，避免各因素之间的交互作用，可以优选出实验中的最佳提取工艺条件范围，以便在实验中来更加明确，细化，留有实际操作空间，以弥补均匀设计和正交设计的大线条和条件筛选狭窄的缺点[9-12]。同时通过星点设计-效应面可以预测出最佳工艺的指标值，以便按其实验条件可以得出实际结果进行比对，通过相对标准偏差来检验实验的准确性。优选的各项指标范围的变化较小，方法稳定可靠，可以更好的适用于工业化大生产。

虽然星点设计-效应面优势明显，但是如果所选择的实验因素较多，水平较多，会使得实验数成倍的增加，实验劳动过程强度会很大[13-14]。故本实验中，通过查阅文献，选择了对处方提取最关键的提取因素，设计了最可能影响实验的因素水平，以便能用较少的实验来优选出最佳提取工艺条件。

有报道[15]，有采用CCD-RSM 法对葛根药材进行了提取工艺研究，选择因素仅考虑了加水量和提取时间，忽略了实验次数因素，本实验中，实验次数对葛根素含量和干膏得率影响较大，故加入了试验次数这个因素进行了工艺优选，使得本实验更加全面。为实验参数的选择提供了较完整的科学依据。

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