某奶牛场细菌混合感染的诊断及药敏试验

李晓娜，许立华，王桂琴

（宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

链球菌病是主要由β溶血性链球菌引起的多种人畜共患病的总称。可引起人类的胸膜炎、败血症等,导致严重疾患，甚至死亡[1]。巴氏杆菌病是一种由多杀性巴氏杆菌引起多种畜禽、野生动物及人类的败血性传染病，以高热、肺炎、急性胃肠炎及内脏广泛出血为主要特征[3-5]。内蒙古鄂尔多斯市某奶牛场为了扩充牛群数量，2013年6月份自陕西省部分牛场购入犊牛及成年母牛。自当年7月份有部分牛表现明显的呼吸道症状，发热、咳嗽或鼻腔分泌物显著增多，并在2周左右的时间里，有1头犊牛及2头成年母牛相继发生死亡，随后牛场采集病死牛的肺脏、心脏、肝脏、脾脏等脏器组织送到宁夏大学农学院兽医传染病实验室进行检测以确定引起本场奶牛发病的病原，通过药敏试验为该场选择抗菌药物给予指导。报告如下。

1 材料与设备

1.1 病料采集 自发病牛场采集3头发病牛（1头犊牛，编号为1；2头成年母牛的编号分别为2、3）的肺脏、心脏、肝脏、脾脏、淋巴结等脏器组织。

1.2 主要培养基、试剂及主要仪器设备 普通营养肉汤培养基、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、血琼脂基础、脱纤维羊血，均购自青岛海博生物技术有限公司；微量生化发酵管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；无菌操作台由苏州净化设备有限公司生产；电热恒温培养箱由上海一恒科学仪器有限公司生产；高压灭菌锅由上海申安医疗机械厂生产；显微镜由南京江南光电股份有限公司生产。

1.3 药敏纸片 头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、头孢氨苄、头孢脞啉、头孢拉啶、多西环素、氨苄西林、阿米卡星、氧氟沙星、恩诺沙星、头孢呋辛钠、链霉素、红霉素、四环素和新霉素，均购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。

2 试验方法

2.1 流行病学调查 对牛群发病情况如发病牛年龄、传染源及传播途径、发病率及病死率等进行调查。

2.2 病理学观察 结合牛场技术人员对病牛的症状描述，对送检的病料进行颜色、质地、形状等大体病变的观察与记录，做出初步的病理学诊断。

2.3 微生物学诊断

2.3.1 涂片镜检 取自3头牛的肺脏、肝脏、脾脏等脏器组织的新鲜切面，直接涂片，革兰染色后，在光学显微镜（油镜）下进行观察，记录细菌的染色特性、形状、大小、排列及分布等特征。

2.3.2 接种培养 对取自3头牛的肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结等脏器组织分别接种到麦康凯培养基、普通营养琼脂、血液琼脂等培养基上，37℃温箱培养18～24 h，观察并记录细菌的生长情况、菌落特征等培养特性。随后分组对不同形态典型菌落进行纯培养。

2.3.3 生化试验 用接种针分别挑取纯培养的细菌，接种于葡萄糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、山梨醇等微量生化发酵管中，37℃进行培养，观察并记录试验结果。

2.4 致病菌的药敏试验 分别挑取自各脏器分离培养的细菌纯培养物接种于生理盐水中调制成0.5麦氏单位的菌悬液，然后用灭菌脱脂棉签蘸取菌悬液涂布于MH琼脂平板上和加血的MH琼脂平板上，待琼脂表面稍干，用消毒镊子正确贴放药敏纸片，每块平板最多贴5片。最后将贴好药敏纸片的平板置37℃温箱中培养24 h，取出观察结果并记录。通过测量各纸片的抑菌圈（mm）大小，参照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）提供的判断标准[6]，确定耐药顺序，进而筛选预防与治疗本病的首选药物。

3 结果

3.1 流行病学调查 自2013年6月从外省购入牛后，该牛场除引进牛外，原来牛群不同年龄段奶牛均有发病表现。因此怀疑此类疾病可通过消化道或呼吸道进行传播。牛群平均发病率为1.26%，且有病死牛。

3.2 病理学观察结果 1号病牛肺脏体积显著肿大，浆膜内有出血现象，肺脏实质有多处干酪样坏死；肺门淋巴结肿大、充血；肝脏、脾脏等病变不明显；2号病牛肺脏体积显著肿大，肺间质显著增宽，在肺表面或切面有空泡分布，呈现明显肺气肿；乳腺质地坚实；肺门淋巴结肿大、充血；心肌表面呈现多处白色、结缔组织增生样病变；肝脏、脾脏等病变不明显；3号病牛肺脏呈灰白色、质地坚实、出现明显肺萎缩；乳腺质地坚实，部分区域的切面呈现干酪样坏死。肝脏、脾脏等病变不明显。

3.3 微生物学诊断结果 染色镜检：发现有革兰阳性菌，呈圆形或卵圆形，单个或呈双链状；另一种革兰阴性菌，细小短杆菌、两端钝圆、近似椭圆形、两极着色明显。培养特性：在血液琼脂平板上生长良好，平板上长出灰白色、表面光滑、边缘整齐的小菌落；另外还出现一种光滑、湿润、边缘整齐、淡灰白小菌落，无溶血现象，折光检验时呈现蓝绿色。在普通培养基及其他培养基上生长均不良。

两种纯培养细菌生化试验结果如表1所示。

表1 两种纯培养菌生化试验结果

由表1结果可见，生化反应结果与链球菌生化反应特点相符[7-8]；表2生化反应结果与巴氏杆菌反应特点相符[9]。

3.4 敏感药物筛选结果 在对发病奶牛各脏器分离培养的细菌纯培养物进行的药敏试验结果显示，该菌对阿米卡星、头孢他啶、头孢曲松敏感性较高。据反馈，所选用的药物临床治疗效果较好。在用药一个疗程之后，症状轻的病牛痊愈，症状严重的病牛病情逐渐好转，精神、食欲也回复正常，牛群中也没有再出现病死牛，病情得到有效控制。

4 讨论

结合流行病学调查、病理学特征、染色镜检可初步判断为巴氏杆菌和链球菌的混合感染，再经培养特性及生化试验进行鉴定，可确诊此次发病是由巴氏杆菌和链球菌混合感染所引发。基于药敏试验结果，建议该场针对此次发病，可选择的治疗药物为阿米卡星、头孢他啶、头孢曲松等。

健康牛的上呼吸道中常有巴氏杆菌和链球菌存在,一般情况下不会引起牛的发病。但是，当牛群因寒冷、季节交替、气候剧变,过度劳累,长途运输或饥饿等应激而降低抵抗力时即可发生内源性感染[10]。引发疾病后,病原体的毒力会增强,并且会随着分泌物和排泄物排出体外,从而污染饲料、饮水、用具、牧地及环境等,以致引起其他健康牛的感染。

该奶牛场在本次牛群发病之前，一直保持良好的管理及运营状态，牛群中犊牛及成年母牛的各种疾病的发病率一直处于较低水平。由于扩充牛群规模而从外地购入一批牛，但对于引进牛的检疫措施没能注重，使得这批牛及混群后所在的牛群中均出现发病，并有一定的病死率。这就提示与建议牛场坚持自繁自养,必须引进种畜时，都应从无疫病区选牛，引进时必须做好检验检疫工作，确保无疫病后方可进场。并在并群前进行3～4周的隔离观察，确保无异常情况时方可混群饲养。

[1]Mazokopakis E E，Koftericlis D P，Papadakis J A，et al.First case report of Streptococcus suis septicaemia and meningitis from Greece[J].Eur J Neurol，2005，12（6）：487-489.

[2]Lopreto C，Lopardo H A，Bardi M C，et al.Primary Streptococcus suis meningitis:first case in humans described in Latin America[J].Enferm Infect Microbiol Clin，2005，23（2）：110.

[3]罗永锋.浅析牛巴氏杆菌病的流行特点和预防[J].中国畜禽种业，2011，7（1）：110-111.

[4]郑聃，郭洪友.牛巴氏杆菌病的发生与防治[J].现代农业科技，2010（4）：364-366.

[5]YU Chun-lei，WANG Jing.Comprehensive prevention of Pasteu⁃rella multocida from rabbits[J].Today Animal Husbandry and Vet⁃erinary Medicine，2008（5）：55.（in Chinese）.

[6]胡继红，高振翔，尹铭芳.美国NCCLS2002年版抗生素药敏试验操作标准更新内容[J].中华检验医学杂志，2002（6）：46-48.

[7]陆承平.兽医微生物学[M].4版.北京：中国农业出版社，2010：89.

[8]拜廷阳，吴志明，刘光辉，等.猪致病性链球菌的分离鉴定[J].动物医学进展，2007，28（11）：34-36.

[9]桂文龙，胡新岗，管远红，等.21株猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].江苏农业科学，2013，41（9）：190-192.

[10]李崇斌，覃克.牛多杀性巴氏杆菌和肺炎链球菌混合感染的诊断与防治[J].广西畜牧兽医，2011，27（3）：167-168.