T LR 4在大肠杆菌引发的奶牛子宫内膜炎中的作用

赵立香，郭梦尧，李丰阳，梁德洁，张乃生

（1.吉林农业科学技术学院制药工程学院，吉林 吉林 132101；2.吉林大学动物医学学院，吉林 长春 130062）

奶牛子宫内膜炎是危害奶牛养殖业的重要疾病，主要导致子宫复旧时间延长、受孕率下降，母牛淘汰率升高，给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。奶牛子宫内膜炎的发生是病原微生物与奶牛自身免疫状态及遗传因素等作用的结果[1]。先天免疫系统首先识别侵入机体的病原，然后信号传导通路，诱导相关免疫细胞的活化和细胞因子分泌，启动获得性免疫应答，杀灭致病菌。病原相关分子模式（PAMP）识别受体可对入侵病原菌识别，是先天免疫反应以及获得性免疫反应的基础[2]。近年来发现，Toll样受体（Toll-like recep⁃tor，TLR）就是一类PAMP识别受体。TLR4可以识别革兰阴性菌细胞壁成分，进而激活下游分子和细胞因子的分泌[3-4]。大肠杆菌是革兰阴性菌，主要引发临床型子宫内膜炎[5]，但其引发奶牛子宫内膜炎的机制仍不清楚。本研究以先天免疫反应中的TLR4为切入点，研究大肠杆菌引发奶牛子宫内膜炎的致病机制。这将有助于对奶牛子宫内膜炎的防控及治疗。

1 材料

1.1 试验动物 健康中国荷斯坦母奶牛10头，体温正常，食欲旺盛，直肠检查：子宫角直径明显缩小，子宫壁弹性良好。由吉林省吉林市规范化养牛养殖场提供。

1.2 药品 双丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris、尿素、EDTA，均购自Promega生物技术有限公司；甲酰胺、TEMED，购自Sigma生物有限公司；PBS、H2SO4、冰醋酸，购自上海化学试剂公司。

1.3 主要试剂 组织蛋白提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、组织RNA提取试剂盒、ELISA检测试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司；SYBR Green Premix Ex Tag试剂盒、TBST、脱脂乳，购自Sigma生物有限公司。

1.4 主要仪器 台式高速离心机，购自上海天美科学仪器公司；半干转膜仪、凝胶电泳成像系统、酶标仪，均购自美国伯乐生物有限公司；水平电泳槽，购自北京君意电泳仪设备厂；荧光定量PCR仪，购自ABI生物有限公司；匀浆器、摇床，购自上海六一仪器厂。

2 方法

2.1 动物模型建立 选取中国荷斯坦奶牛10头。其中，2头不做处理（A），4头子宫灌注无菌的LB肉汤培养基（B），4头子宫灌注大肠杆菌菌液（C）。7～10 d后，灌注细菌组临床表现为：精神沉郁，体温升高，采食减少，由阴门流出灰褐（白）色有腐臭味的黏液，子宫颈口周围有脓性分泌物附着，直肠检查：子宫角松软、增粗，子宫壁增厚，弹性减弱等。对照组A和无菌的LB肉汤培养基B组奶牛无异常临床表现。

2.2 子宫内膜样品采集 利用子宫内膜活检采样器采集子宫内膜样品。将已经无菌处理的采样器以直肠把握法送入子宫内。经直肠用手将子宫壁用力按压到采样器的凹口，闭合采样器，切下子宫内膜组织，再取出采样器，将子宫内膜样品放于已灭菌的小瓶中，以备实验检测。

2.3 TNF-α、IL-1β、IL-6检测 子宫内膜样品组织匀浆后，12000 r/min离心收集上清液。ELISA板一抗包被，4℃过夜。洗板液清洗4次，注入样品稀释液（200μL/孔），室温振荡1 h。加入待测样品100 μL，20℃振荡2 h，PBS洗板3次，加入二抗，洗板3次，之后加入显色液，用浓度2 mmol/L H2SO4100μL注入各孔以终止显色。用酶标仪测定OD450nm值，根据已经绘制的标准曲线计算浓度。

2.4 实时荧光定量PCR分析 利用组织RNA提取试剂盒提取子宫黏膜总RNA。通过测定OD260值检测RNA的浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。依据TaKaRa公司反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链。

cDNA样品梯度稀释后构建标准曲线，线性回归分析。利用real-time PCR反应的S动力学曲线和解离曲线检测方法是否可靠。使用SYBR Pre⁃mix Ex Tag试剂盒，25μL体系进行实时荧光定量PCR：上、下游引物（10 pmol/μL）各1μL，模板cD⁃NA 2.5μL，Rox Reference DyeⅡ1.7μL，缓冲液11 μL，灭菌双蒸水7.8μL。反应条件为：95℃35 s；95℃ 5 s，60 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，40个循环。每个样品3个重复孔，采用相对定量法分析结果。

2.5 Western Blot分析 子宫黏膜组织匀浆后，加入预先裂解液，置于摇床缓慢震荡5 min，然后10000 r/min（4℃）离心20 min，取上清液进行SDS-PAGE分析，并用半干转膜仪转膜，50 g/L脱脂乳封闭2 h，然后4℃，孵育一抗，过夜。TBST漂洗4次，每次5 min，孵育二抗。化学发光ECL显色，观察。

3 结果

3.1 炎性细胞因子分泌情况 将收集到的子宫内膜样品标记后，利用匀浆器进行组织匀浆。12000 r/min离心后收集上清液，弃去沉淀。按照TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒说明书操作进行测定。用酶标仪测OD450nm值，根据标准曲线计算各组样品中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度。结果如图1所示。大肠杆菌刺激后，炎性因子均明显上升。TNF-α、IL-1β变化尤为明显，分泌量增加（P＜0.05）。IL-6也有所升高，但变化不大（P＜0.05）。子宫灌注无菌的液体培养基实验组TNF-α、IL-1β、IL-6略微有所增多，但无明显统计学意义。

图1 炎性细胞因子分泌水平

3.2 TLR4基因及蛋白表达变化 TLR4是识别革兰阴性菌的主要受体蛋白。试验结果显示，大剂量的大肠杆菌作用于牛的子宫内膜组织，TLR4 mRNA表达水平明显升高（如图2a所示）。进一步对TLR4蛋白表达进行分析，与A、B组相比，C组大肠杆菌刺激能明显地增加TLR4蛋白的表达（P＜0.05）。表明大肠杆菌刺激能促进TLR4 mRNA及LR4蛋白的表达（如图2b所示）。

图2 TLR4基因及蛋白表达水平

3.3 NF-κB信号通路的影响 NF-κB信号通路与炎症关系非常紧密，是TLR4下游的关键调控节点。为进一步研究大肠杆菌的致炎机制，对NF-κB信号通路进行检测。试验结果显示，给予大肠杆菌刺激牛的子宫内膜组织后，NF-κB mRNA表达水平明显升高（如图3a所示），其抑制蛋白I-κB mRNA表达也明显升高（见图3b）。对NF-κB蛋白分析发现，大肠杆菌对NF-κB蛋白表达无影响，但会促进NF-κB磷酸化。相对应的，大肠杆菌刺激明显地增加了I-κB磷酸化蛋白的表达（P＜0.05）。表明大肠杆菌刺激NF-κB蛋白磷酸化，并促进I-κB与NF-κB蛋白的解离，从而减少其抑制作用（如图4所示）。

4 讨论

图3 NF-κB与I-κB基因表达水平

图4 NF-κB信号通路蛋白表达水平

大肠杆菌引发急性子宫内膜炎与TLR4密切相关。子宫内膜组织TLR4发挥对大肠杆菌的识别作用，受到大肠杆菌刺激后TLR4表达增加。进一步激活NF-κB信号通路的NF-κB蛋白磷酸化及I-κB与NF-κB蛋白的解离，NF-κB入核启动相关因子基因，从而导致TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子表达增多。由于这种刺激呈现暴发式的反映效果，所以患牛在TNF-α、IL-1β、IL-6作用下，表现出典型的临床症状。

5 结论

结果表明，奶牛子宫内膜组织表达TLR4受体。大肠杆菌引发奶牛子宫内膜炎过程与TLR4的作用密切相关，其导致的信号通路活化和炎性细胞因子的分泌，可能受到TLR4的调节。大肠杆菌刺激后，炎性因子均明显上升。TLR4基因及蛋白表达、NF-κB蛋白磷酸化都有所增强。

[1]李世宏，杨国林，杨锐乐，等.奶牛子宫内膜炎研究进展[J].中国奶牛，2007，1：34-38.

[2]Liu G，Zhang L，Zhao Y.Modulation of immune responses through direct activation of Toll-like receptors to T cells[J].CLIN EXP IMMUNOL，2010，160（2）：168-175.

[3]Bellocchio S，Moretti S，Perruccio K，et al.TLRs govern neutrophil activity in aspergillosis[J].J Immunol，2004，173（12）：7406-7415.

[4] Murphy T J，NI Choileain N，Zang Y，et al.CD4+CD25+regulatory T cells control innate immune reactivity after injury[J].J Immu⁃nol，2005，174（5）：2957-2963.

[5]赵红霞，李培锋，吴聪明，等.奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的分离血清型鉴定及其耐药性测定[J].中国兽医杂志，2009，45（4）：22-23.