塞来昔布抑制人胰腺癌细胞系PANC-1的增殖、侵袭、迁移能力

谷倬宇，李 军*，李思源，肖智伟，周 婷

(石河子大学 医学院 1.第一附属医院 内分泌代谢科； 2.新疆地方与民族高发病教育部重点实验室；3.第一附属医院 中心实验室， 新疆 石河子 832002)



研究论文

塞来昔布抑制人胰腺癌细胞系PANC-1的增殖、侵袭、迁移能力

谷倬宇1,2#，李 军1,2#*，李思源2，肖智伟2，周 婷3

(石河子大学 医学院 1.第一附属医院 内分泌代谢科； 2.新疆地方与民族高发病教育部重点实验室；3.第一附属医院 中心实验室， 新疆 石河子 832002)

目的探讨COX-2抑制剂塞来昔布对人胰腺癌细胞系PANC-1增殖、侵袭、迁移能力的影响，确定塞来昔布作用的最佳浓度和最适宜的应用时间。 方法不同浓度的塞来昔布(20、60和100 μmol/L)处理胰腺癌细胞不同时间(24、48和72 h)后，用MTT比色法检测细胞的增殖能力；用Transwell实验检测细胞的侵袭能力；采用细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。 结果MTT结果显示塞来昔布作用后胰腺癌细胞的增殖能力下降，呈时间和浓度依赖性(P<0.05)；Transwell侵袭实验结果显示塞来昔布作用后胰腺癌细胞的侵袭能力下降，呈浓度依赖性(P<0.01)；划痕实验结果显示塞来昔布作用后胰腺癌细胞的迁移能力下降，呈浓度依赖性(P<0.01)。 结论塞来昔布以浓度梯度、时间梯度的形式减弱人胰腺癌细胞系PANC-1的增殖能力，以浓度梯度的形式减弱人胰腺癌细胞系PANC-1的侵袭及迁移能力。

胰腺癌; 塞来昔布; 增殖; 侵袭；迁移

选择性COX-2抑制剂塞来昔布是临床上常用的非甾体类抗炎药物之一，近年来研究发现塞来昔布具有抗肿瘤作用[1]，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移[2-4]。胰腺癌恶性程度极高，侵袭和转移是其最重要的生物学特征[5]。然而目前塞来昔布在胰腺癌中的作用尚未见报道，作用机制尚不明确。本实验通过不同浓度COX-2抑制剂塞来昔布作用于人胰腺癌细胞系PANC-1，观察其对胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响，旨在探讨塞来昔布对胰腺癌的作用，确定塞来昔布的最佳作用浓度和最适宜的应用时间。

1 材料与方法

1.1 材料

人胰腺癌细胞系PANC-1(中国科学院细胞库)，胎牛血清和DMEM培养基(Gibco公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)，塞来昔布(瑞辉公司)，Matrigel胶(BD公司)，Transwell侵袭小室(Costar公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组处理:PANC-1细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2的培养箱中进行细胞培养。细胞贴壁增殖，每3天传代1次，取对数增殖期细胞进行实验。塞来昔布溶于DMSO中，配成0.1 mmol/L浓度原液，用DMEM培养基稀释成所需要的浓度，并使DMSO终浓度<0.1%。实验分为溶剂对照组和药物干预组。以0.1%终浓度的DMSO作为溶剂对照组。药物干预组DMEM中塞来昔布终浓度分别为0、20、60和100 μmol/L。

1.2.2 MTT增殖实验:调整细胞悬液浓度为105/mL，每孔100 μL加入96孔板中，至细胞单层铺满孔底，次日吸出各孔内培养基，分组方法同上，每组设3个复孔。培养箱中分别孵育24、48和72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，避光继续培养4 h后吸去孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，低速振荡后在酶标仪490 nm波长处读取A值，空白孔调零，重复3次。

1.2.3 Transwell 侵袭实验:Matrigel用无血清DMEM培养基以1∶5比例进行稀释后，75 μL/孔铺于Transwell小室的上层滤膜上，37 ℃无菌保持过夜，待Matrigel形成胶后备用。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105/mL，上室加入200 μL含塞来昔布的DMEM，下室加入600 μL完全培养基，分组方法同上，每组设3个复孔。孵育24 h后取出上室，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定，12孔板中加入0.1%结晶紫500 μL，将小室置于其中，30 min后取出镜下观察，随机选取5个视野照相计数，以侵袭细胞数目来表示细胞的侵袭能力。

1.2.4 划痕实验:6孔板背后每隔0.8 cm划一道横线，每孔穿过3条线，调整细胞悬液浓度为105/mL铺板，过夜铺满。次日用枪头垂直于背后横线划痕，复制损伤模型，用PBS冲洗后加入培养液，分组方法同上，每组3个复孔。放入培养箱中孵育。按0和24 h观察取样，拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 塞来昔布对PANC-1细胞增殖能力的影响

经过不同浓度和不同处理时间，塞来昔布作用于PANC-1细胞后，细胞的增殖能力均不同程度地受到抑制，呈时间和浓度依赖性趋势(P<0.05)(表1)。

2.2 塞来昔布对PANC-1细胞形态学的影响

正常PANC-1细胞呈梭形或多角形，少数呈类圆形，核大有分裂象，突起少而短。培养基中加入塞来昔布24 h后，与正常细胞比较，细胞变圆、缩小、老化，随药物浓度的升高，细胞的数目开始减少并开始出现死细胞(图1)。

2.3 塞来昔布对PANC-1细胞侵袭能力的影响

与对照组比较，塞来昔布作用于PANC-1细胞后，细胞的侵袭能力逐渐下降，呈浓度依赖性趋势(P<0.01)(图2,表1)。

2.4 塞来昔布对PANC-1细胞迁移能力的影响

与对照组比较，塞来昔布作用于PANC-1细胞后，细胞的迁移能力逐渐下降，呈浓度依赖性趋势(P<0.01) (图3,表1)。

表1 塞来昔布对PANC-1细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

A.normal PANC-1 cell; B.60 μmol/L celecoxib group; C.100 μmol/L celecoxib group

图3 塞来昔布对PANC-1细胞迁移能力的影响

3 讨论

胰腺癌临床表现隐匿、进展迅速、预后极差，极易侵入周围组织间隙而扩散，形成侵袭和转移[6]。发达国家每年因患胰腺癌死亡人数高达2万，中国的发病情况与国外类似，胰腺癌发病率与死亡率逐年增长[7- 8]。研究发现选择性COX-2抑制剂的抗肿瘤机制主要是诱导细胞凋亡、调控细胞周期和影响肿瘤新生血管生成等[9- 11]，但COX-2抑制剂在胰腺癌细胞中的作用尚不明确。

本实验首先测定了COX-2抑制剂塞来昔布对PANC-1细胞的体外增殖能力影响。结果发现随着塞来昔布浓度的增加，24、48和72 h后细胞生长的增殖率均逐渐降低，且该作用呈浓度依赖性，这与最新的文献报道相近[12]。从实验结果还可以看出，48和72 h后塞来昔布对细胞增殖出现明显抑制，抑制率开始高于50%，因此侵袭和划痕实验的处理时间要限定在24 h内，以排除药物对细胞增殖明显抑制后细胞数目及状态的干扰。侵袭结果提示，塞来昔布可以显著地抑制细胞体外穿越基底膜的能力，减弱细胞向下室的趋化作用，使细胞的侵袭能力下降。划痕结果同样提示24 h后，细胞向划痕中央迁移的速度明显减慢，塞来昔布浓度越高，对细胞迁移能力的抑制作用越明显，这与侵袭结果保持一致。以上结果和细胞形态学图片提示当塞来昔布浓度为100 μmol/L时其抗胰腺癌作用最为明显，且呈浓度依赖性。

综上所述，COX-2抑制剂塞来昔布以浓度梯度和时间梯度的形式减弱人胰腺癌细胞系PANC-1的增殖能力，以浓度梯度的形式减弱人胰腺癌细胞系PANC-1的侵袭及迁移能力，起到抗胰腺癌作用。对COX-2抑制剂的深入研究有利于进一步揭示胰腺癌的侵袭转移机制并为新的抗胰腺癌药物的研发提供依据。

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Celecoxib inhibits proliferation, invasion and migration of human pancreatic cancer cell line PANC-1invitro

GU Zhuo-yu1,2#，LI Jun1,2#*，LI Si-yuan2，XIAO Zhi-wei2，ZHOU Ting3

(1.Dept. of Endocrinology and Metabolism, First Affiliated Hospital; 2.Key Laboratory of Ministry of Education, Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases; 3.the Central Laboratory, First Affiliated Hospital, Shihezi University School of Medicine, Shihezi 832002, China)

Objective To investigate the effects of cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib on proliferation, invasion and migration of human pancreatic cancer cell line PANC-1 and then determine the optimal concentration of celecoxib and the most suitable application time. Methods Human pancreatic cancer cell line PANC-1 was treated with diverse concentrations of celecoxib (20,60,100 μmol/L) for different durations (24,48,72 h). Cell proliferation, invasion and migration capabilities were measured by MTT colorimetry, Transwell invasion assay, and scratch assay respectively. Results The proliferation capability of PANC-1 cell was reduced by celecoxib in a concentration- and time-dependent manner (P<0.05). In addition, the invasion and migration capabilities were decreased by celecoxib in a concentration-dependent manner(P<0.01). Conclusions Celecoxib attenuates the

proliferation of human pancreatic cancer cell line PANC-1 in a concentration- and time-dependent manner. Celecoxib attenuates the invasion and migration in a concentration-dependent manner.

pancreatic cancer; celecoxib; proliferation; invasion; migration

2014- 08- 14

2014- 11- 22

新疆生产建设兵团国际合作基金(2011BC005);新疆研究生科研创新项目(XJGRI2014063)

1001-6325(2015)01-0065-04

R735.9

A

*通信作者(corresponding author)：xjlijun@163.com

#对本文研究有相同贡献