小檗碱对糖尿病大鼠脑内与血中Aβ的影响

周 游，谭 颖，张文君，刘 琳，赵 瑛

(哈尔滨商业大学药学院，哈尔滨150076)

随着糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)发病率的快速上升，其引起的认知损害也正在引起广泛关注[1－2].关于糖尿病认知功能损害，现在学术界公认的观点认为与脑老化及痴呆有密切关系，痴呆是以脑内β－淀粉样多肽(β－amyloid，Aβ)产生和清除这两者失衡有关[3].早在20世纪就已经出现关于糖尿病认知功能损害的报道，但目前糖尿病认知功能损害的药物治疗仍然处于探索阶段，至今尚无一个有效的药物用于临床.小檗碱自20世纪80年代被发现其在糖尿病治疗上的疗效以来，很多学者就其调节血糖、改善胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)等作用进行大量临床观察及实验研究，研究表明，小檗碱对胰岛素抵抗、糖代谢紊乱等均有良好的干预作用[4－5].已知糖尿病认知障碍的发生机制涉及胰岛素信号受损、糖代谢受损、氧化应激、炎症等方面，故本课题选用小檗碱作为受试药物，通过测定其对认知功能障碍核心病理特征Aβ质量浓度的影响，从而为糖尿病认知损害的药物干预提供研究基础.

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用清洁级Wistar大鼠，雄性60只，体重(200±20)g，8～10周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号:SCXK(京)2012－0001.普通饲料配方如下:53%玉米粉，24%豆饼粉，16%麦麸，5%鱼粉，1%骨粉，1%食盐.高脂饲料配方如下:猪油10%，蛋黄粉10%，胆固醇1%，胆酸钠0.5%，基础饲料78.5%，购于黑龙江中医药大学.

1.2 主要试剂

葡萄糖测定试剂盒(购自长春汇力生物科技有限公司，批号120912);胰岛素放射免疫分析试剂盒(购自潍坊三维生物工程集团有限公司，批号121229);链脲佐菌素(Sigma分装，批号S0130，购自北京博爱科贸有限公司);吡咯列酮(荔诺生物，批号201012);小檗碱(大连美伦生物科技有限公司，批号201203).

1.3 主要仪器

酶标分析仪 (RAYTO公司，型号 RT－6000);低温高速离心机(Sigma公司，3K30公司);双蒸水机(上海亚荣生化仪器厂，型号SZ－93A);超低温冰箱(SANYO公司);电子天平(上海跃平科学仪器有限公司，型号FA－1004B).

2 实验方法

2.1 糖尿病模型的复制

普通食水适应性饲养1周后，大鼠按体重随机分为2组:空白组(n=15)、高脂组(n=45).其中模型组给予高脂饲料，连续喂养8周.然后，禁食不禁水16 h，以冰浴的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液将STZ粉末溶解，新鲜配制1%的STZ溶液，模型组按照给药剂量35mg/kg腹腔注射，冰上避光操作，10 min内注射完毕，复制具有外周胰岛素抵抗的糖尿病模型.空白组腹腔注射同剂量柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液.注射STZ 72h后眼底静脉丛取血检测空腹血糖、空腹血胰岛素水平，计算胰岛素敏感指数，选择空腹血糖≥16.7mmol/L动物纳入实验[6].

2.2 动物分组给药

糖尿病模型组大鼠依据血糖随机分为模型组(n=12)、小檗碱高剂量组(n=10)对小檗碱高剂量组(n=10)和吡咯列酮组(n=10).给药期间，空白组给予普通饲料喂养，同时以蒸馏水灌胃;模型组给予高脂饲料，同时以蒸馏水灌胃;小檗碱高、低剂量组给药剂量分别为 129.45mg/kg·d、64.72mg/kg·d，吡咯列酮组给药剂量为2.72 mg/kg·d，各药物组同时给予高脂饲料.以上各组每日灌胃1次，给药持续8周至动物处死.

2.3 标本制备

2.3.1 血浆样本

实验期间，采用眼底静脉丛进行取血，时间点分别是:高脂饲料喂养8周、腹腔注射1%STZ 72 h、药物治疗8周时.所有大鼠禁食不禁水过夜16 h，然后球后静脉丛取血 1.5 mL，离心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)，吸取上清，－80 ℃冻存待测.

2.3.2 脑组织样本

于小檗碱给药8周后取材，各组大鼠3%戊巴比妥钠将大鼠麻醉后，立即断头处死，在冰盘上快速取脑，去除脑干及小脑，置0～4℃生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，迅速放入预冷的玻璃匀浆器中，加入重量体积比(1∶9)的冰冷生理盐水，0～4℃条件下快速匀浆.组织被均匀粉碎后在恒温下进行离心(5 000 r/min，10 min，4℃)，吸取上清待测.

2.4 糖尿病大鼠观察指标

2.4.1 动物一般状态观测

整个实验过程中观察动物活动情况、毛色，每天监测动物的进食量、饮水量.

2.4.2 糖尿病大鼠代谢笼的测定

实验过程中每天观察大鼠的一般状态，每隔30d采用代谢笼测定动物摄食、饮水量、粪便量和尿量，每只动物晚19:00给定量的食水，至次日上午7:00测量剩余量，两者的差值即为每只大鼠每12h的饮食、水量，通过代谢笼称量大鼠粪便重量和尿液体积.

2.4.3 血糖浓度 (FBG)测定

实验前，更换垫料，禁食16 h，自由饮水.大鼠乙醚麻醉，眼底静脉丛取血0.5 mL，肝素抗凝，离心(3 000 r/min，10 min)，分离血浆待测.吸取上清，采用葡萄糖氧化法测定空腹血糖.

2.4.4 血胰岛素浓度 (FINS)测定

方法同上，采用放射免疫分析法测定血浆胰岛素的含量.

2.4.5 胰岛素敏感指数 (IAI)

计算公式为:IAI=ln[1/(FPG×FINS)].

2.4.6 血中、脑中 Aβ40、Aβ42 质量浓度测定

双抗体夹心酶联免疫吸附法测定，Aβ质量浓度以两者之和计算.具体操作按试剂盒说明书严格操作进行.

2.5 统计学处理

采用SPSS 21.0 For Windows统计软件进行处理.结果用平均值±标准差()表示，采用单因素方差分析.P＜0.05说明有显著性差异，P＜0.01说明有非常显著性差异.

3 实验结果

3.1 高脂饮食对大鼠体重的影响

与空白组相比，高脂饲料喂养8周，高脂组大鼠体重增加较快，体重由(231.72±11.63)g增加至(342.89 ±42.32)g(P ＜0.01).一次性腹腔注射1%STZ 72 h 后，体重下降(P ＜0.05).见表1.

表1 高脂饮食对大鼠体重的影响(g，±s)

表1 高脂饮食对大鼠体重的影响(g，±s)

与空白组比较，*P＜0.05有显著性差异，＊＊P＜0.01有非常显著性差异

组别 N 1周 6周 8周 STZ 72h(g)空白组 12 227.79 ±21.94 284.89 ±33.37 304.76 ±37.45 312.89 ± 34.23高脂组 42 231.72 ±11.63 317.85 ±40.86＊＊ 342.89 ±42.32＊＊ 324.34 ±26.77*

3.2 高脂饮食对大鼠血糖、胰岛素、胰岛素敏感指数的影响

结果表明:与空白组相比，高脂组大鼠血糖显著增高(P＜0.01)，胰岛素非常显著增高(P＜0.01)，胰岛素敏感指数显著降低(P＜0.05).结果提示，长期高脂饮食已经造成外周胰岛素显著增加，胰岛素敏感指数降低，大鼠出现胰岛素抵抗现象，血糖增高(P ＜0.05).见表2.

表2 高脂对血糖、胰岛素、胰岛素敏感指数的影响(±s)

表2 高脂对血糖、胰岛素、胰岛素敏感指数的影响(±s)

与空白组比较，*P＜0.05有显著性差异，＊＊P＜0.01有非常显著性差异

胰岛素敏感指数组别 N 血糖mmol/L胰岛素μIU/L空白组12 4.73 ±1.58 21.19 ±6.14 －4.57 ±0.46高脂组 42 7.81 ±1.18*34.79 ±6.74＊＊－6.26 ±0.58*

3.3 糖尿病大鼠糖代谢指标

与空白组相比，腹腔注射1%STZ 72 h后，糖尿病大鼠出现精神萎靡不振、毛发散乱、枯黄，稀便、食水摄入增加、体重减轻等状态，这与临床上糖尿病患者症状表现类似.

3.3.1 糖尿病大鼠代谢笼的变化

结果表明:与空白组相比，模型组大鼠腹腔注射STZ后饮水量、饮食量、粪便量、尿量都显著性增加(P ＜0.05;P ＜0.01).见表3.

表3 糖尿病大鼠饮食量，饮水量，尿量，粪便量(±s)

表3 糖尿病大鼠饮食量，饮水量，尿量，粪便量(±s)

与空白组比较，*P＜0.05有显著性差异，＊＊P＜0.01有非常显著性差异

组别 N 饮食量(g/d)饮水量(mL/d)尿量(mL/d)粪便量(g/d)空白组 12 11.28 ±3.07 47.18 ±17.14 23.45 ±12.24 5.29 ±1.25模型组 37 18.72 ±0.58* 100.50 ±23.30＊＊ 69.41 ±20.92＊＊ 10.57 ±2.19＊＊

3.3.2 糖尿病大鼠血糖、胰岛素的变化

实验结果表明:高脂大鼠腹腔注射STZ后，与空白组比较，空腹血糖显著增加(P＜0.01)，血清胰岛素变化不显著.见表4.

表4 糖尿病大鼠血糖、胰岛素的含量

3.4 小檗碱对糖尿病大鼠Aβ的改善作用

结果表明:与空白相比，模型组大鼠脑内Aβ显著性增加(P＜0.01);与模型组组比较，小檗碱高剂量组能显著性降低脑中Aβ的质量浓度(P＜0.01)，小檗碱低剂量组有降低趋势，但无统计学意义.吡咯列酮组有显著性差异(P＜0.05).见表5.

表5 小檗碱对血中与脑内Aβ的影响(pg/mL，±s)

表5 小檗碱对血中与脑内Aβ的影响(pg/mL，±s)

与空白组比较，*P＜0.05有显著性差异，＊＊ P ＜0.01有非常显著性差异与模型组比较，△P＜0.05有显著性差异，△△P ＜0.01有非常显著性差异

组别 N 血Aβ 脑Aβ 10 116.92 ±5.61 200.99 ±5.59模型组 9 125.61 ±7.12＊＊ 999.22 ±85.08＊＊小檗碱高剂量 9 113.28±4.71△△ 201.29±19.11△△小檗碱低剂量 10 122.47 ±2.78 691.33 ±73.53吡咯列酮 9 116.98±3.39△ 653.69±58.63空白组△

4 讨论

随着社会老年化日益显著，糖尿病和痴呆是影响老年人健康的主要两大疾患.临床研究发现，糖尿病患者及胰岛素抵抗的慢性高胰岛素血症患者，其认知功能减退甚至痴呆发生的危险性均显著增高[7].研究显示，胰岛素抵抗与痴呆的病理生理特征密切相关，而在痴呆形成过程中以大脑皮层及海马区的Aβ的沉积为核心病理特征.基于以上的认识，本课题研究的是伴有胰岛素抵抗过程的糖尿病形成过程中Aβ的变化.

本实验采用高脂饮食喂饲联合小剂量35 mg/kg腹腔注射1%STZ的方法建立糖尿病模型.实验发现，与空白组相比，高脂喂饲8周后，IAI显著性降低，FPG显著升高但未达到16.7 mmol/L，此时诱发大鼠产生胰岛素抵抗是糖尿病早期缺陷.此时大鼠的胰岛素水平虽高于正常，但它与胰岛素受体的结合能力以及受体后的效应均减弱，故而出现高胰岛素血症.

本实验发现糖尿病成模后，模型组大鼠反应迟钝，活动度低，抓起时明显排便反应，皮毛无光泽，枯黄等现象，本实验结果提示:与空白组相比，糖尿病大鼠8周时，脑内与血中Aβ明显增加，表明糖尿病能促进大鼠脑内和血中Aβ的生成.

研究表明，具有胰岛素增敏作用中药单体小檗碱能够改善胰岛素抵抗过程中的糖脂代谢指标及其胰岛素信号传导过程中的相关分子，作用明确[8－9].本次实验发现，小檗碱可以降低糖尿病大鼠脑内和血中Aβ的质量浓度，目前已知小檗碱具有明显的改善糖尿病糖脂代谢，改善胰岛素抵抗，那么小檗碱能否通过改善糖脂代谢来发挥降低脑内和血中Aβ的作用呢?需要进一步研究进行证实.

实验期间，小檗碱高剂量组个别动物出现摄食减少，精神状态萎靡，毛色枯黄等现象，死亡动物脏器肉眼检查主要表现为各肠段胀气较明显，腹部胀气严重，肠壁变薄，胃部胀大，内部有食物残留，其余脏器均未发现明显病变.虽然小檗碱有原料易获得等优点但其不良反应也限制其在临床上的应用，在今后的实验中，小檗碱应在改善剂型及给药途径等方面做进一步研究.

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