北五味子中三萜总皂苷提取工艺优化

吴 伦，高 翔，田振坤

(黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨150040)

北五味子为木兰科五味子的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》，列为上品，主产于辽宁、吉林、黑龙江等地.北五味子具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心的功能.主要用于久嗽虚喘，梦遗滑精，久泻不止心悸失眠等[1].木脂素类化合物是北五味子主要活性成分，而三萜皂苷类成分研究较少[2－3].本实验采用正交试验法对北五味子皂苷类成分提取工艺进行研究，并对北五味子总皂苷采用D－101大孔树脂吸附法进行分离、富集和纯化，旨在对北五味子中皂苷类成分深入研究提供科学依据.

1 仪器与试药

756PC型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);旋转蒸发器(东京理化株式会社);五味子药材(清河五味子药材基地);AL204型电子天平(梅特勒－托利多上海有限公司);HH－S型恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂);齐墩果酸(中国食品药品检定研究院);冰醋酸(天津广成化学试剂有限公司);香草醛(天津光复精细化工研究所);D－101大孔吸附树脂(河北宝恩吸附材料科技有限公司)，所有试剂均为分析纯.药材采自黑龙江省清河育林林场，经黑龙江中医药大学药用植物研究室鉴定为北五味子的干燥果实.

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 供试品溶液的制备

称取五味子药材适量，以乙醇作为溶剂，按照实验设计的方法进行提取，将煎煮液浓缩，得到五味子提取浸膏，加适量水稀释得到五味子上样液，过D－101型大孔树脂，收集洗脱液，蒸干后用甲醇定容，摇匀即得.

2.1.2 五味子总三萜皂苷的量测定[4－5]

精密称取齐墩果酸3.1 mg，置于25 mL容量瓶中，使用甲醇定容，摇匀即得.精密量取对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，采用 60 ℃水浴蒸干溶剂，加入0.2 mL新制的5%香草醛冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，摇匀，60℃水浴15 min，冷却至室温，加0.5 mL冰醋酸，于645 nm处测定吸光度.以齐墩果酸质量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程Y=0.008 6X+0.051 1，R=0.999 4.

2.1.3 精密度实验

精密称取齐墩果酸对照品2.0 mg，置于25 mL容量瓶中，按照2.1.2项下测定方法操作，连续5次重复测定皂苷的量，得到RSD值为1.89%，结果表面精密度良好.

2.1.4 稳定性实验

精密称取齐墩果酸对照品2.0 mg，置于25 mL容量瓶中，按2.1.2项下测定方法操作，分别于0、15、30、45、60 min时间点测定吸光度.得到 RSD 值为2.96%，结果表明样品在60 min内，稳定性较好.

2.1.5 加样回收率实验

取已知皂苷的量的样品5份，精密加入一定量的齐墩果酸对照品溶液，按照2.1.1项下的方法制备溶液并测定齐墩果酸的量，平均回收率为104.18%，得到的RSD 值为1.46%.

2.2 大孔吸附树脂的选择和预处理

近年来，大孔吸附树脂色谱因具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快等特点被广泛应用于中药有效成分或有效部位的分离富集.五味子属植物中三萜的基本骨架有5种，大多以三萜酸和三萜内酯形式存在.五味子中主要含有基本母核为羊毛甾烷型四环三萜类成分与D－101型大孔树脂具有特异性吸附[6－7].大孔树脂吸附法可以避开很多种有毒的有机溶剂，仅用到了乙醇，且大孔吸附树脂还可进行再生，该方法简便又有效.因此，本文采用大孔吸附树脂对五味子煎煮液进行梯度洗脱，本实验中具体采用的大孔吸附树脂类型为 D －101 型[8－9].

取一定量的D－101型大孔吸附树脂，用95%乙醇在室温下密封浸泡24 h后，采用湿法装柱，用95%乙醇进行冲洗，洗至流出液与水2∶1混合不再产生混浊，再用蒸馏水洗至无醇味后备用.

2.3 五味子提取最优工艺的选择

通过正交试验来考察不同的提取条件对北五味子总皂苷的量的影响，筛选出最佳的提取工艺[10].

2.3.1 正交实验设计[11－12]

选择乙醇体积分数，提取时间，乙醇用量，提取次数4个因素，以总皂苷的量作为评价指标，选用L9(34)正交表进行实验.见表1～3.

表1 水平因素

表2 正交实验与结果

表3 方差分析

2.3.2 结果分析

极差分析结果表明，各因素对总皂苷的量影响主次顺序为C＞A＞D＞B，即乙醇用量＞乙醇体积分数＞提取次数＞提取时间，因此，A2B2C3D3为北五味子总皂苷提取的最佳方案.表3方差分析表明，溶媒用量(乙醇用量)对结果的影响具有极显著性意义.

2.3.3 工艺验证

根据以上正交试验结果，对优选出的工艺条件A2B2C3D3进行三次重复实验，以验证该工艺的稳定性，测得总皂苷平均的量为2.03%，RSD值为2.51%，结果表明无显著性差异.因此，最佳的提取工艺为乙醇体积分数70%，溶媒用量10倍，提取次数为3次，2 h/次.

本试验通过正交设计法筛选出五味子的最佳提取工艺，同时采用了大孔树脂吸附法对北五味子中总皂苷进行富集纯化.D－101型大孔吸附树脂对北五味子皂苷类成分的富集纯化效果较好，且工艺简单，成本要求低.由于五味子中的三萜类化合物主要是羊毛甾烷型四环三萜类，根据北五味子中三萜类的结构特征，采用结构特点与其相似的五环三萜类齐墩果酸作为对照品，通过测定齐墩果酸的吸光度来评价北五味子中三萜皂苷的量.根据试验中方法学考察的结果，该方法的重复性和回收率均较好，结果准确.

本文所采用的提取和富集纯化方法稳定可行，可对北五味子总皂苷的工业化生产提供理论支持.鉴于目前对北五味子中三萜皂苷类化合物研究较少的现状，亦为北五味子中皂苷成分的进一步研究提供了数据支持和参考依据.

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