正交试验法优选白术多糖的提取工艺

袁海梅，李鸿翔，彭 腾

(1.成都大学 生物工程学院，四川 成都 610106;2.成都中医药大学 药学院 教育部中药材标准化重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 610075)

0 引 言

白术多糖为白术的重要组成成分，研究发现，其具有多种药理作用:增强大鼠神经细胞抗氧化能力及减少DNA 损伤［1］;可减轻自体肝移植大鼠肝脏缺血再灌注损伤［2］;对腺嘌呤诱发的慢性肾功能衰竭的大鼠肾脏具有一定的保护作用［3］;可以促进人外周血来源的树突状细胞表型及功能的成熟［4］;对婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌的促生长效果最佳，具有良好的促生长效果［5］;通过降低凋亡基因及蛋白的产生，上调抗凋亡基因及蛋白的产生，提高Bcl-2/Bax 的比值达到抗神经细胞缺氧性凋亡作用［6］.为了更好地开发利用白术这一植物资源，本研究以白术多糖收率为考察指标，以煎煮次数、煎煮时间、煎煮倍数为考察因素，采用正交实验法优选白术多糖的最佳提取工艺，拟为白术多糖的进一步开发利用提供参考依据.

1 仪器与材料

1.1 仪 器

试验所用仪器包括:RE-2000B 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义予华仪器有限责任公司)，马头牌JYT-2型架盘药物天平(上海医用激光仪器厂)，UV-1100型紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)，ZDZ5-WS 型离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司).

1.2 材 料

葡萄糖购于中国药品生物制品鉴定所(批号，110833－200503);白术饮片购于四川新荷花药材饮片有限公司(批号，0907034)，经成都中医药大学蒋桂华教授鉴定为正品;实验所用溶剂均为分析纯.

2 方 法

2.1 正交试验设计［7－9］

根据药材提取过程中的影响因素，选定煎煮次数(A)、煎煮时间(B)和煎煮倍数(C)3 个因素为考察指标，以精制多糖的收率为评价指标，不考虑各因素的相互影响.因素与水平设计如表1 所示.

表1 试验因素水平表

2.2 对照品溶液制备

精密称取葡萄糖对照品0.05134 g，加蒸馏水定容至50 mL，精密吸取5 mL 置50 mL 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，制得对照品溶液.

2.3 供试品溶液制备

称取白术药材粗粉30 g，按正交表设计实验，煎煮，合并水煎液，抽滤，滤液减压浓缩至100 mL，加入85%的乙醇调节至60%，放置24 h，以3 500 r/min 离心10 min，得白术粗多糖，采用95%的乙醇、丙酮依次洗涤，减压干燥24 h，即得粗多糖.精密称取白术粗多糖0.2 g，置于100 mL 容量瓶中，加入蒸馏水，沸水浴中加热30 min 溶解，放至室温，定容至刻度.精密吸取10 mL，置100 mL 容量瓶中，摇匀，定容至刻度，制得供试品溶液.

2.4 多糖溶出率

精密吸取供试品溶液0.6 mL 于具塞试管中，精密吸取0.4 mL 蒸馏水于具塞试管中，立即加入蒽酮试剂4.0 mL，沸水浴中煮沸10 min，冰浴冷却至室温，测定吸光度，计算多糖溶出率，其计算公式为，

3 结 果

3.1 葡萄糖标准曲线的制作

精密吸取葡萄糖标准溶液，配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液，在620 nm 波长下测定各试管中溶液的吸光度A.以标准葡萄糖含量(μg)为横坐标，以吸光度A 为纵坐标，回归方程为，

y=0.0054x+0.1094，R2=0.9998

结果表明，其在20.52 ～102.6 mg 范围内呈良好的线性关系，结果如表2 所示.

表2 葡萄糖标准溶液的线性关系

3.2 精密度试验

精密吸取同一份对照品溶液，按供试品制备方法制备，测定其6 次吸光度A，计算RSD.结果显示，RSD=3.05%(n=6)，表明方法的精密度良好.

3.3 重复性试验

精密吸取同一份供试品溶液，按供试品制备方法制备6 份，测定吸光度A，计算白术药材多糖溶出率，求得RSD=2.25%(n=6)，表明方法的重现性良好.

3.4 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液，按供试品制备方法制备，测定吸光度A，每30 min 测定1 次，连续2 h，求得RSD=1.47%(n=5)，表明方法的稳定性良好.

3.5 加样回收率

精密量取1 号供试品溶液0.5 mL，6 份，精密加入0.2 mL 标准葡萄糖溶液，0.3 mL 蒸馏水，按供试品制备方法制备，测定吸光度A.结果显示，加样回收率平均值为94.57%，RSD=4.75%.

3.6 正交试验结果

精密吸取1 至9 号白术多糖溶液0.6 mL，按供试品制备方法制备，测定吸光度A，计算白术多糖溶出率.正交试验结果与显著性检验见表3、表4.

表3 正交试验结果

表4 显著性检验

从表3 的正交试验结果可知，由煎煮次数(A)、煎煮时间(B)和煎煮倍数(C)3 组K 值得极差值来分析，各影响因素对多糖提取工艺的贡献率大小依次为煎煮次数(A)、煎煮倍数(C)、煎煮时间(B).根据多糖溶出率，煎煮次数(A)的最佳水平3，煎煮时间(B)的最佳水平3，煎煮倍数(C)的最佳水平3.从表4 的方差分析结果，因素煎煮时间(B)对实验结果影响显著，表明煎煮时间(B)对白术多糖提取工艺影响最强，因素煎煮次数(A)和煎煮倍数(C)对实验结果影响不显著，则煎煮次数(A)和煎煮倍数(C)对提取工艺影响一般，各个因素对白术多糖的提取工艺的影响程度为，煎煮时间(B)＞煎煮次数(A)＞煎煮倍数(C)，但从经济有效的角度出发，本研究选择A2B3C2为最优化工艺条件，即:提取次数为2 次，提取时间1.5 h，加水量为药材的10 倍.3.7 验证试验

按照最佳提取工艺A2B3C2制备3 批样品，并测定样品中白术多糖的含量，其结果见表5.结果表明，在该工艺条件下，白术多糖的溶出率高，工艺稳定.

表5 工艺验证试验结果

4 讨 论

白术多糖作为白术的重要组成成分，毒性小，生物利用度高，具有明显的免疫增强作用.目前，白术多糖已用于食品添加剂，以及作为临床药物用于恢复期肿瘤病人或化疗时辅助应用.为了更好地开发利用白术这一植物资源，本研究采用正交设计的方法对白术多糖的提取工艺进行了研究，得出了提取白术多糖的最佳提取工艺.结果显示，本提取工艺合理，稳定可行，可为白术多糖的进一步开发利用提供参考.

［1］马庆华，马庆华，郭红艳，等.白术多糖对D-半乳糖致衰大鼠神经细胞抗氧化作用研究［J］.中国老年学杂志，2006，26(12):1658－1600.

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［3］冯星，邱细敏，黄亚林，等.平江白术多糖对腺嘌呤致大鼠肾衰模型的保护作用［J］.食品科学，2010，31(9):276－278.

［4］汲广全，陈仁琼，郑建仙.白术多糖对树突状细胞表型及功能成熟的影响［J］.食品科学，2015，36(3):207－211.

［5］刘丽莎，王锐，旭日花，等.白术多糖对益生菌的促生长作用及结构分析［J］.食品科学，2011，31(19):124－128.

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［7］郑礼娟，秦昆明.多指标正交试验优选白术芍药散提取工艺［J］.中国中药杂志，2013，38(10):1504－1509.