不同分子标记在菠萝中检测效率的比较

王健胜 贺军虎 陈华蕊 陈业渊

摘要：以来自不同国家的47份菠萝[Ananas comosus （L.） Merr]种质为材料，对ISSR、SSR、SCoT和RAPD 4种标记在菠萝基因组中的检测效率进行了比较。结果表明，不同分子标记检测效率差异较大，引物筛选率以RAPD最高，达到了47.06%；扩增总条带数和多态性条带数均以ISSR最高，分别为238条和222条；而多态性条带百分比最高的是SSR，达到了92.88%；在有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性指数（H）、Shannons信息指数（I）和多态性信息含量（PIC）方面，SCoT和SSR综合表现要优于其他标记。

关键词：菠萝[Ananas comosus （L.） Merr]；分子标记；检测效率

中图分类号：S668.3；Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2676-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.031

Comparison on the Detection Efficiency of Different Types of

Molecular Markers in Pineapple

WANG Jian-sheng1，HE Jun-hu2，CHEN Hua-rui2，CHEN Ye-yuan2

（1. Pingdingshan University， Pingdingshan 467000， Henan， China；

2. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737， Hainan， China）

Abstract： Taking forty seven pineapple germplasms originated from the different countries as material， the detection efficiency in pineapple genome was compared for four types of molecular marker including ISSR，SSR，SCoT and RAPD. Results showed that there was the great difference among the different types of molecular markers. The higher ratio of primer screening was found for RAPD with 47.06%； The greater number of total producing bands and polymorphic bands was all detected for ISSR with 238 and 222，respectively； SSR had the higher percentage of polymorphic bands to the total bands，and its percentage of polymorphic bands reach to 92.88%. For the effective allele number， Neis gene diversity index，Shannons information index and polymorphism information content，SCoT and SSR performed better than other molecular markers.

Key words： pineapple[Ananas comosus （L.） Merr]； molecular marker； detection efficiency

菠萝[Ananas comosus （L.） Merr]属凤梨科凤梨属，原产于南美洲，是一种重要的多年生常绿草本果树，与香蕉、芒果、椰子合称世界四大热带水果。近年来，随着世界菠萝需求量的大幅增加以及菠萝产业的快速发展，越来越多的国家开始重视对菠萝的基础研究。分子标记作为一种稳定、高效、便利的研究技术在许多植物研究中已得到了广泛的应用。与其他主要农作物相比，分子标记应用于菠萝的研究相对较晚，虽然如此，利用不同分子标记国内外学者针对菠萝也作了一些初步较好的研究。目前，包括AFLP[1，2]、RFLP[3]、RAPD[4]、SSR[5]、SCoT[6]和SRAP[7]等多种分子标记已被较好地应用于菠萝研究中。

由于不同分子标记的设计特性决定了其在菠萝基因组中具有不同的检测效率，而比较不同分子标记的检测效率对菠萝研究中分子标记方法的选择以及菠萝相关遗传研究都极为关键，但截至目前，有关此方面的研究仍未见报道。为此，利用RAPD、ISSR、SSR、SCoT对来自世界不同国家的多种菠萝种质进行了研究，着重比较了不同分子标记在菠萝基因组中的检测效率，以期为菠萝分子标记研究水平提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验共选用了47份菠萝种质，来源于世界上不同国家或地区，主要包括中国台湾、中国海南、巴西、日本、印度尼西亚、澳大利亚、泰国、哥斯达黎加、毛里求斯。试验材料由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。

1.2 DNA提取

每份材料随机选取10～15株单株的幼嫩叶片等量混合，采用改良的SDS法[8]混合提取基因组总DNA，经紫外分光光度计测定浓度后，稀释至适合工作浓度备用。

1.3 分子标记检测

PCR扩增反应在Eppendorf PCR扩增仪上完成。PCR反应总体积20 μL，反应体系的组成根据不同类型分子标记的特点对基因组DNA、引物、10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶和ddH2O进行相应的调整。PCR扩增程序也根据不同分子标记特点确定。对SSR扩增产物主要采用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，其他标记则通过1.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4 数据统计及分析

以0、1、9统计SCoT扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”，并建立分子数据矩阵。采用POPGEN32软件估算SCoT标记的主要遗传多样性参数，包括引物扩增总条带数（TNB）、多态性条带数（NPB）、多态性条带百分比（PPB）、有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性指数（H）、Shannons信息指数（I）和多态性信息含量（PIC）。

2 结果与分析

2.1 不同分子标记多态性引物在菠萝中的筛选率比较

利用两个表型性状差异明显的菠萝种质对不同类型分子标记进行了筛选，具体信息见表1。从表1可以看出，不同分子标记在菠萝种质中的筛选率差异较大，其中RAPD标记的筛选率最高，达到了47.06%，其次是ISSR标记，筛选率为43.33%，SSR标记和SCoT标记的筛选率都较低，分别为28.57%和24.44%。这种筛选率的状况在一定程度上也反映了不同分子标记的特点及差异，作为随机扩增标记的RAPD和ISSR，由于不具有种属特异性而具有很高的多态性引物筛选率，而具有特异种属限制的SSR标记其筛选率就相对较低，虽然SCoT也是一种随机扩增引物，但其筛选率却较低，这可能与其设计特性有关。

2.2 不同分子标记在菠萝基因组中的扩增信息比较

不同分子标记在菠萝基因组中扩增差异较大，从表2可知，不同分子标记在扩增总条带、多态性条带及多态性条带百分比方面都存在明显差异。在扩增总条带方面，ISSR表现最好，其单个引物最多扩增出了238个条带，其平均扩增条带数也达到了140.86，这在4种类型标记中都是最高的；其次是RAPD标记，其单个引物扩增条带数平均为123.57；SCoT标记和SSR标记平均扩增条带数相对较低，其中SSR标记最差，其单个引物平均扩增条带数只有80.75。4种标记在多态性条带方面与扩增总条带数有所不同，单个引物扩增多态性条带数平均值最高为124.57，最低只有75，4种标记单个引物扩增平均多态性条带数从大到小顺序为ISSR、SCoT、RAPD、SSR。另外可以看出，每种分子标记不同引物间无论是在扩增总条带数目还是在多态性条带数目方面差异都很大。与扩增条带数不同，多态性条带百分比可以比较综合地反映出不同分子标记的多态性检测效率，从表2以看出，4种分子标记间多态性条带百分比差异较大，其中SSR的多态性条带百分比最高，达到了92.88%，其次是ISSR和SCoT，其多态性条带百分比比较接近，都在88%，RAPD多态性条带百分比最低，只有78.49%。从以上分析可以看出，在菠萝基因组扩增方面，SSR和ISSR表现相对较好。

2.3 不同分子标记主要遗传多样性参数比较

试验也对不同分子标记的主要遗传多样性参数进行了比较，具体见表3。从表3可以看出，不同分子标记在3种主要遗传参数方面差异较大。在有效等位基因数方面，4种标记中RAPD表现最好，其平均值最大，达到了1.46，其次是SCoT标记，其表现与RAPD十分接近，平均值也达到了1.45，ISSR的有效等位基因数最低，只有1.35；同时可以看出，每种标记不同引物间有效等位基因数变化都较大，其中以SCoT和RAPD的变化为最大。在Neis基因多样性指数方面，不同类型标记间差异相对较小，其中SCoT的Neis基因多样性指数最大，其次是SSR和RAPD，ISSR相对最小。4种标记的Shannons信息指数介于前两个参数之间，其中，SSR和SCoT的Shannons信息指数相对较大，都达到了0.41，RAPD为0.39，ISSR最小，只有0.36。从4种分子标记主要遗传多样性参数来看，SCoT和SSR综合表现相对较好。

2.4 不同分子标记多态性信息量比较

多态性信息量是进行分子标记评价的重要参数，故试验对4种分子标记的多态性信息量进行了比较分析。从表4可以看出，不同分子标记间多态性信息量变化都较大，其极差介于0.23～0.42之间，其中SCoT标记变化最大，而ISSR标记的变化最小。从多态性信息量的极值表现来看，SCoT和SSR的最大值表现最好，而RAPD的最小值表现最差。多态性信息量平均值可以较均衡地反映出不同分子标记间的差异，可以看出SCoT标记多态性信息量整体表现最好，其平均值达到了0.30，其次是SSR标记，其平均值略低于SCoT，为0.29，而ISSR和RAPD标记的多态性信息量较低，都为0.24。从4种分子标记多态性信息量的综合表现来看，SCoT和SSR相对最好。

3 小结与讨论

分子标记技术的应用有效加快了菠萝遗传育种及其相关研究的进展，而在分子标记应用中，基因组检测效率是较为重要的一项内容，同时它也是开展菠萝其他相关遗传研究的重要基础。近年来，随着新的分子标记技术的不断开发，越来越多的分子标记被逐步应用于菠萝研究中，而不同分子标记的设计特点决定了其在菠萝基因组多态性检测中具有特定的检测效率，因此开展不同分子标记在菠萝中检测效率的比较分析较为重要。试验对ISSR、SSR、SCoT、RAPD 4种分子标记在菠萝中的检测效率进行了比较分析，选取了可用于检测效率比较的多种考查指标，主要包括引物筛选率、基因组扩增条带数、多态性条带百分比、有效等位基因数、Neis基因多样性指数、Shannons信息指数和多态性信息含量，结果表明，各分子标记在不同检测指标方面表现各有优劣，例如，RAPD在引物筛选率方面表现最好，ISSR在扩增条带数方面最为突出，而SCoT和SSR的主要遗传多样性参数相对较高，因此，在利用分子标记进行菠萝种质研究时，应该根据特定的研究目标及研究条件等选择适合的标记类型，当然多种类型分子标记的有效结合无疑是获得理想研究结果的有效途径。关于不同分子标记的效率比较分析，在其他如油菜[9]、葡萄[10]、中药材[11]、柳枝稷[12]等上已开展了较多的研究，但与本研究相比，这些研究不仅选用的分子标记类型较少，而且在分子标记比较时选取的考察指标少且单一，因此，本研究结果在为菠萝分子标记的高效利用提供重要科学依据的同时，对其他植物分子标记的应用及相关研究也具有一定的参考价值。

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