生物酶制剂对采后菜心毒死蜱残留的降解作用

丁杰+张菁+刘婕++何玥++钟国华

摘要：建立了菜心毒死蜱残留气相色谱检测方法，在0.01～2.00 mg/L浓度范围内具有良好的线性关系，回收率为77%～89%，变异系数在2.0%～7.9%之间。供试酶制剂对采后菜心毒死蜱残留具有明显的去除效果，去除率与起始处理的毒死蜱浓度和降解酶制剂的稀释倍数有关。菜心起始浸泡浓度为毒死蜱有效成分400、40、4 mg/L时，分别以降解酶制剂稀释1倍（即原液）、10倍、100倍处理，结果表明，稀释倍数为1倍和10倍时，总体差异不明显，毒死蜱残留去除率均保持在84%～96%，但稀释100倍时，显著低于前两者，去除率分别为59.41%、79.59%和66.77%。根据试验结果，供试的生物降解酶制剂去除采后菜心毒死蜱的适宜稀释倍数为10～100倍，对4～400 mg/L菜心毒死蜱残留可有效去除59%～92%。

关键词：酶制剂；毒死蜱；菜心；降解

中图分类号：S481.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2644-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.022

Degradation of Chlorpyrifos Residual by Enzyme Preparation

in Postharvest Chinese Flowering Cabbage

DING Jie1，ZHANG Jing1，LIU Jie1，HE Yue2，ZHONG Guo-hua1

（ 1. Lab of Insect Toxicology， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China； 2. Zhuhai Supervision & Testing Institute of Quality and Metrology， Zhuhai 519075， Guangdong，China）

Abstract：Chinese flowering cabbage of chlorpyrifos residue gas chromatography method was established，which showed good linear relationship with the concentration of 0.01～2.00 mg/L and the recovery was 77%～89%，and coefficient variation was 2.0%～7.9%.The selected enzyme preparation had obvious removal effect to chlorpyrifos residue in postharvest Chinese flowering cabbage and the removal rate was related to the dilution ratio and the initial concentration of chlorpyrifos.The removal of chlorpyrifos was determined by diluting the preparation to 1，10 and 100 times with Chinese flowering cabbage chlorpyrifos active ingredients initial concentrations of 400 mg/L，40 mg/L and 4 mg/L， respectively. Results showed that the removal rate of chlorpyrifos was 84%～96% when dilution ratios were 1 and 10 times. However， removal rate of 100 times diluted preparation was remarkably lower than the former two preparations which were 59.41%，79.59% and 66.77%，respectively.According to the experimental results， the most appropriate dilution ratio of enzyme preparation was 10 to 100 times and 59%～92% of chlorpyrifos residue was eliminated.

Key words： enzyme preparation； chlorpyrifos； Chinese flowering cabbage； degradation

毒死蜱（Chlorpyrifos）是一种高效、广谱、中等毒性的有机磷酸酯类杀虫剂，广泛应用于水稻、果树、蔬菜等作物害虫防治，是目前全球应用最广泛的5种杀虫剂之一。我国农林业从20世纪末开始使用毒死蜱，特别是由于剧毒有机磷农药逐渐被限制生产和使用，客观上促使毒死蜱用量大增。但大量研究表明，即使是极低剂量毒死蜱残留仍具有显著的生物毒性内分泌干扰作用，长期大量累积可能会对人类呼吸系统、心血管系统、神经系统、甚至免疫系统产生危害[1]，尤其对儿童健康有害[2]，国际上对毒死蜱的监管甚严[3]。因此，必须寻找新技术解决毒死蜱的生产应用与保证农产品安全之间的矛盾。筛选高效降解菌，提取降解酶，是国际上解决农药残留的发展方向和研究热点之一[4，5]。国内外研究表明，生物降解是控制和去除毒死蜱残留的有效途径之一。在前期研究中，华南农业大学胡美英教授课题组自主筛选获得了毒死蜱高效降解真菌，提取其粗酶液，深入研究了其分子特征[6]，研究了粗酶液制剂配方的优化，研制成可应用于农产品毒死蜱生物降解的制剂[7]。本文定量评估了制剂对采后菜心表面毒死蜱残留的降解效果，旨在为今后商品化生产生物降解酶制剂处理农产品毒死蜱等有机磷农药残留提供理论基础。endprint

1 材料与方法

1.1 菌种和降解酶制剂

毒死蜱高效降解菌株Cladosporium cladosporioides （Fresen.） de Vries HP-Z-01，由华南农业大学胡美英教授课题组从农药厂废水中分离筛选获得，中国典型培养物保藏中心菌种保存号CCTCCM20711。降解酶制剂为液体制剂，配制基本配方和基础参数见文献[7]，在此基础上进行技术改进制备所得，制剂中粗酶蛋白含量按Bradford法测定为1 000 mg/kg，制剂制备后置于阴凉处贮存3个月内使用。

1.2 药品试剂与仪器

97%毒死蜱原药、48%毒死蜱乳油（乐斯本），美国陶氏益农公司惠赠，同时选取具有清洗果蔬表面农药残留功能的某品牌果蔬清洗剂A作为对照，其余所用试剂均为国产分析纯试剂；毒死蜱残留浓度分析采用HP-6890气相色谱仪（美国惠普公司），冷冻高速离心机、旋转蒸发仪、高速组织捣碎机、HS-3C精密pH计、超净工作台、DHZ-D冷冻恒温振荡器、电热恒温水浴锅、超声波清洗器等均为国产常规仪器。

1.3 毒死蜱残留量GC检测

以1702-MP8型电子天平准确称取97%毒死蜱原药0.010 3 g于10 mL容量瓶，加入丙酮，定容得到1 000 mg/L毒死蜱标样工作母液。按照梯度稀释法，分别配制0.01、0.10、0.50、1.00、2.00 mg/L溶液，仪器稳定后分别由低浓度到高浓度进样GC分析，每浓度3次重复，以毒死蜱浓度为X，峰面积为Y，制作标准曲线。

菜心毒死蜱残留量GC测定前处理方法参考GB/T 5009.20-2003《食品中有机磷农药残留量的测定方法》，稍加改进以便更加适合实际条件。主要过程如下：无水硫酸钠（分析纯）150 ℃烘6 h，活性炭用3 mol/L盐酸浸泡过夜过滤，洗至中性，120 ℃烘干。准确称取菜心样品10.0 g，加二氯甲烷70.0 mL，用匀浆机匀浆后置于250 mL具塞三角瓶中，加无水硫酸钠30～100 g脱水，剧烈振荡后如有固体硫酸钠存在，说明所加无水硫酸钠已经足够。加活性炭0.2～0.8 g脱色，振荡0.5 h，滤纸过滤，用30.0 mL二氯甲烷分3次洗涤滤渣，合并滤液，旋转蒸发浓缩近干，用二氯甲烷定容至5.0 mL，保存待测，外标法定量。

准确称取若干份未经施用农药的菜心叶片10.0 g，分别添加1 mL不同浓度的毒死蜱标准溶液，使其添加终浓度为0.01、0.05和0.10 mg/kg，按上述方法进行前处理，按确定的GC方法检测，计算添加回收率。

1.4 降解酶制剂对采后菜心毒死蜱残留的降解效果测定

参照文献[8]的方法，采集未经施用农药的菜心叶片200 g，在2 L 48%毒死蜱乳油对水稀释成1 200倍、12 000倍和120 000倍（即浓度分别为400、40、4 mg/L）的药液中，并置于80 r/min的摇床中，5 min后取出，后用清水冲洗1次（不超过30 s），晾干水分后，分别置于降解酶制剂1倍、10倍和100倍溶液中，果蔬清洗剂A1 000倍溶液中（该产品没有具体提供使用倍数，按洗涤剂常量偏高量使用），以清水作对照，浸泡时菜心务必全部浸没。浸泡30 min，取出后按照常规洗涤方式漂洗1次，每个处理3次重复。按“1.3”方法进行前处理（叶片和叶梗不分开）和GC检测，评价降解酶制剂对毒死蜱的降解效果。

2 结果与分析

2.1 毒死蜱残留GC测定条件

经反复试验，确定毒死蜱残留GC检测条件如下：色谱柱为DB-1701毛细管柱（30 m×0.32 mm×1.0 μm），柱温为100 ℃（1 min） ■250 ℃（10 min），柱流量3 mL/min，进样口温度220 ℃，载气为N2（纯度99.999%），压力20 psi，进样量2 μL，分流比2.0，吹扫时间0.75 min，吹扫量60 mL/min，H2为3 mL/min，空气60 mL/min，NPD检测器，检测器温度280 ℃。在上述检测条件下，毒死蜱标准样品保留时间为13.680 min，峰形尖锐、对称、稳定。以毒死蜱浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，标准曲线方程为y=1E7x-135 027，相关系数R2=0.999 9，相关性显著，方法可信。

添加回收率测定结果表明，在未施用农药的菜叶10.0 g中，添加不同浓度的毒死蜱标样各1 mL，使其添加终浓度分别为0.01、0.05和0.10 mg/kg时，毒死蜱的添加回收率分别为77.01%、88.91%和84.66%，变异系数为2.00%～7.85%，说明该分析方法稳定可靠（表1）。

2.2 降解酶制剂对菜心毒死蜱残留的采后降解效果

按“2.1”所确定的方法，48%毒死蜱EC用清水稀释成有效成分400、40、4 mg/L药液浸泡5 min后，清水冲洗后再用降解酶制剂稀释液浸泡处理菜心表面的毒死蜱残留，然后用GC法测定残留浓度，评价酶制剂降解效果，结果见图1和图2。结果表明，菜心起始浸泡浓度为400、40、4 mg/L时，清水对照组毒死蜱残留浓度分别为21.88、13.82、3.37 mg/L，而以降解酶制剂稀释1倍（即原液）、10倍、100倍处理后，菜心毒死蜱残留量均显著低于清水对照组（图1），但毒死蜱残留去除率与处理起始浓度和制剂稀释倍数有关，稀释倍数为1倍和10倍时，总体差异不明显，毒死蜱残留去除率均保持在84%～96%，但稀释100倍时，显著低于前两者。稀释100倍时，起始处理浓度400、40、4 mg/L时，去除率分别为59.41%、79.59%和66.77%（图2），说明起始处理浓度越高，去除率越低，同时也说明酶制剂对低残留毒死蜱的降解作用更明显。作为对照的果蔬清洗剂A稀释1 000倍处理时，毒死蜱残留量同样明显降低，但其不同于酶制剂的是，当起始处理浓度为400 mg/L处理时，毒死蜱残留去除率可达70.93%，但起始处理浓度降低至40 mg/L和4 mg/L时，残留去除率分别降低至47.40%和40.65%（图2）。endprint

3 结论与讨论

作为高毒有机磷农药的替代品种，毒死蜱应用广泛，但其安全性一直是国内外关注的重点[9-11]。本试验在确定菜心毒死蜱残留GC分析方法的基础上，研究了降解酶制剂对采后菜心毒死蜱的降解处理效果。结果表明，该降解酶制剂性能较稳定，适应范围较宽，实际应用时，适宜稀释倍数为10～100倍，对4～400 mg/L菜心毒死蜱残留可有效去除59%～92%。

农药残留降解酶制剂的稀释倍数决定降解效果和使用成本。本研究结果表明，供试降解酶制剂对菜心毒死蜱残留的降解去除效果，主要与毒死蜱起始浓度和降解酶制剂稀释倍数相关。在试验中，当酶制剂稀释倍数在1倍和10倍时，菜心中毒死蜱起始处理浓度为400 mg/L时，去除率均在85%以上，起始处理浓度为40 mg/L时，去除率为91%以上，差异不明显；但酶制剂稀释倍数提高到100倍时，在毒死蜱起始处理浓度为400 mg/L高浓度时，残留毒死蜱去除率不到60%，但在起始处理浓度为40 mg/L和4 mg/L时，残留毒死蜱去除率分别为79.59%和66.77%。今后仍需深入研究降解效率与残留浓度和稀释倍数之间的关系，以指导降解酶制剂的实践使用。

生物酶制剂的特点之一是能够对低残留的目标物质同样有较好的去除作用[12，13]。本研究中，处理起始处理浓度40 mg/L和4 mg/L时，果蔬清洗剂A稀释1 000倍对菜心样品残留毒死蜱的去除率仅为47.40%和40.65%，但供试酶制剂稀释100倍时仍有79.59%和66.77%的去除率。这个结果一方面说明供试酶制剂可能具有与清洗剂完全不同的去除机制，另一方面，从解决实际问题的角度出发，酶制剂这种特性更具有实践应用价值，因为一般情况下，菜心等果蔬农产品中的毒死蜱等有机磷农药残留量一般在10 mg/kg以下，从保障消费者健康的角度出发，如果研制开发的生物酶制剂能显著降解低残留毒死蜱时，则更具有实用价值。本研究结果充分体现了所研制的生物降解酶制剂对低残留农药的降解作用，值得进一步研究开发。然而，本研究仅测定了供试降解酶制剂对毒死蜱的降解效果，对于其他有机磷或其他化学农药的降解效果如何，仍有待进一步深入研究。此外，今后应继续研究优化降解酶制剂，以提高降解效果，降低使用成本，使其更具有实际应用前景。

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