Mortalin促进人乳腺癌细胞MDA-MB231的恶性进展

金海丹，周宪春，张松男，林贞花，金铁峰*

(延边大学 1.肿瘤研究所; 2.延边大学附属医院 肿瘤科, 吉林 延吉 133002)



Mortalin促进人乳腺癌细胞MDA-MB231的恶性进展

金海丹1#，周宪春1#，张松男2，林贞花1，金铁峰1*

(延边大学 1.肿瘤研究所; 2.延边大学附属医院 肿瘤科, 吉林 延吉 133002)

全球每年有超过100万乳腺癌新发病例，转移是其难治的主要原因。Mortalin又名HSP70，是热休克蛋白(Heat Shock Proteins)家族中的一员，最初发现于鼠胚胎纤维母细胞[1]。肝癌、结直肠癌和卵巢癌等的研究表明，Mortalin在肿瘤发生发展过程中起到了重要的作用，但Mortalin在乳腺癌的研究较少。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition EMT)是肿瘤发生迁移、侵袭，维持干细胞样特征及抗凋亡的关键步骤[2]。本实验旨在研究Mortalin对人乳腺癌MDA-MB231细胞生物学行为的影响，探讨其促进肿瘤恶性进展的可能机制，为临床治疗乳腺癌提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料：MDA-MB231(简称M- 231)细胞系(ATCC)；RPMI 1640培养基、胎牛血清(Gibco公司)、胰蛋白酶(Santa Cruz 公司)；鼠抗人 Mortalin抗体(Sigma公司)。ECL试剂盒(Pierce公司)，基质胶(BD公司)，Transwell板(Corning公司)，EMT相关抗体(Cell signaling公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及慢病毒转染：人乳腺癌细胞系M- 231置于含10%胎牛血清的1640培养基中，37 ℃、5% CO2常规培养。含人Mortalin的慢病毒载体由上海Genechem公司构建、包装并进行测序证实。用1×107个慢病毒传导单位和空载体的病毒上清液分别感染3×103个M- 231细胞。感染96 h后，用嘌呤霉素(1 mg/L)筛选稳定表达Mortalin的靶细胞。最后利用Western blot法鉴定Mortalin的表达情况。

1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖能力：取对数增殖期的M- 231及M- 231/Mor细胞以2×103个/孔接种于96孔板中，每组设5个平行复孔。分别于24、48和72 h后加入50 μL/孔的MTT，4 h后弃上清，加入200 μL/孔的DMSO，轻轻振荡数分钟，应用全波长多功能酶标仪，在570 nm波长处测定其吸光度值，并计算细胞生存率。

1.2.3 Western blot 检测：将M- 231及M- 231/Mor细胞以冷PBS洗2次后提取总蛋白；BCA法测定蛋白浓度；8%SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行蛋白分离；转至PVDF膜上；室温下摇床封闭(TBST+5%脱脂奶粉)2 h；加入一抗；4 ℃过夜；洗膜后加入辣根过氧化物酶二抗；孵育2 h；ECL曝光；观察并拍照；实验重复3次。

1.2.4 细胞体外侵袭实验：在transwell 小室(Corning公司)滤膜的上表面铺以100 μL matrigel(1 mg/mL, Becton-dickinson公司)于37 ℃作用1 h 备用。以3×105个细胞加入transwell小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的DMEM，37 ℃培养箱孵育24 h，用棉签擦净膜上室面细胞，HE染色后，在倒置显微镜下观察。

2 结果

2.1 Mortalin过表达M- 231细胞系的建立:建立Mortlin高表达细胞株M- 231/Mor后检测蛋白表达发现其Mortalin，p-Akt及Akt的表达均升高(P<0.05)(图1，表1)。

表1 M- 231与M- 231/Mor相对蛋白表达

groupmortalinP-Akttotal-AktM-2310.153±0.0320.254±0.0110.352±0.016M-231/Mor0.431±0.086**1.168±0.036**0.505±0.053*

*P<0.05,**P<0.01 compared with M- 231.

图1 M- 231与M- 231/Mor蛋白表达比较Fig 1 Compared of the protein expression with M- 231 and M- 231/Mor

2.2 M- 231/Mor较M- 231具有更高的增殖及迁移能力:在48及72 h， M- 231/Mor较M- 231细胞增殖能力明显增强(P<0.01)(图2)。M- 231/Mor细胞的迁移率明显高于M- 231细胞(图3)。

*P<0.01 compared with M- 231 group图2 M- 231/Mor增殖能力明显增强Fig 2 Significantly enhanced the proliferation in M- 231/Mor cells

图3 Mortalin过表达诱导乳腺癌细胞侵袭性增强Fig 3 Mortalin enhanced the migration in M- 231 cells(×100)

2.3 Mortalin诱导M- 231细胞EMT发生:M- 231/Mor上皮表型标志物E-cadherin表达明显下调，同时间质表型vimentin及fibronectin表达明显上调(图4，表2)。

图4 Mortalin对EMT相关标志物表达的影响Fig 4 The impact of Mortalin on the expression of EMT-related markers

groupE-cadherin/β-actinvimentin/β-actinfibronectin/β-actinM-2311.811±0.0241.014±0.0230.085±0.011M-231/Mor0.065±0.014**1.371±0.041*0.221±0.016**

*P<0.05,**P<0.01 compared with M- 231 group.

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，早期原位癌生存率较高，而一旦发生转移其预后较差。因此，找出参与乳腺癌发生转移相关的分子靶点和信号通路是治疗乳腺癌的关键。Mortalin蛋白在许多人类肿瘤中表达上调，有研究证实Mortalin蛋白过表达可以促进乳腺癌细胞的恶性进展[3]。目前有关EMT与恶性肿瘤发生浸润、侵袭及转移的研究已经成为肿瘤治疗新的热点。在EMT起始阶段，上皮E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达下调是EMT最重要的生物学标志[4]，其他如间质标志物波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)等的表达增强，共同促使细胞骨架重排，运动迁移能力增加，上皮来源的细胞向间质来源的细胞转化完成。

通过慢病毒转染成功构建Mortalin过表达的乳腺癌细胞系M- 231/Mor。研究结果表明，较之转染前的M- 231细胞系，Mortalin表达明显上调，而且癌基因Akt及其磷酸化蛋白p-Akt表达也明显增强。同时Mortlin具有促进肿瘤细胞的增殖及侵袭的能力。进一步的研究结果表明，Mortalin促进E-cadherin表达下调及vimentin、fibronectin的表达上调。

综上所述，Mortalin蛋白可以促进乳腺癌细胞MDA-MB231的恶性进展，其机制部分是通过诱导其EMT的发生而实现的。Mortalin蛋白有望成为临床判断乳腺癌预后并为其分子靶向治疗提供新的靶点。

[1] Renu Wadhwa, Sunil C.Kaul, Yoji Ikawa,etal. Identification of a novel member of mouse hsp70 family. Its association with cellular mortal phenotype [J]. J Biol Chem, 1993, 268:6615- 6621.

[2] Ru P, Steele R, Newhall P,etal. miRNA- 29b suppressesprostate cancer metastasis by regulating epithelial-mesenchymal transition signaling [J]. Mol Cancer Ther, 2012, 11:1166- 1173.

[3] Peinado H, Olmeda D, Cano A. Snail, Zeb and bHLH factors in tumour progression: an alliance against the epithelial phenotype?[J] Nat Rev Cancer, 2007, 7:415- 428.

[4] Sabbah M, Emami S, Redeuilh G,etal. Molecular signature and therapeutic perspective of the epithelial-to-mesenchymal transitions in epithelial cancers[J]. Drug Resist Update, 2008, 11:123- 151.

2014- 07- 04

2014- 10- 22

国家自然科学基金(61371067)

1001-6325(2015)06-0833-03

R 734.2； R 730.5

A

*通信作者(corresponding author)：jintf@ybu.edu.cn

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