转基因棉花研究与应用进展

李常凤　郑曙峰

摘 要：转基因技术在棉花种质创新和新品种选育方面取得了较大发展。该文综述了棉花转基因技术方法，系统地论述了转基因在棉花抗虫、抗除草剂、抗病、抗逆境以及高产优质等方面的研究进展，分析了转基因棉花产业相关问题，并概述了转基因抗虫棉育种成就及潜力。

关键词：棉花；转基因技术；研究进展；综述

中图分类号 S562 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）03-04-17-05

Abstract：Great progress through transgenic technology have been made on cotton germplasm innovation and breeding. This paper summarized transgenic cotton advances in insect resistance，herbicide tolerance，disease resistance，stress tolerance，as well as yield and quality improvement of fiber. Meanwhile，an assessment of transgenic cotton industry and its potential in transgenic breeding were present.

Key words：Cotton；Transgenic technology；Research progress；Summarize

棉花（Gossypium hirsutum L.）是我国重要的经济作物，是关系国计民生的重要战略物资。长期以来，以杂交育种为主的传统育种技术在提高棉花产量、纤维品质以及抗逆性等方面取得了一定进展，并获得了可观的社会效益和经济效益。但由于棉花产量性状和品质性状之间呈现遗传负相关，单纯依靠常规育种技术在较短时间内难以实现棉花产量和纤维品质的大幅度同步提要[1-2]。现代生物技术尤其植物基因工程的迅速发展为棉花种质资源创新提供了新的思路和方法，它可以打破物种间的生殖隔离，通过直接或间接的转移手段有目的、有计划的向棉花体内引入控制性状遗传的优良基因，在无需改变原有特性的条件下，打破基因不良连锁，实现生物性状的定向改变。利用转基因技术手段提高棉花产量、改良纤维品质以及增强抗虫、抗病和抗逆性，是常规育种的重要补充。我国早在20世纪80年代末就开始了转基因棉花的研究与开发利用，现就棉花转基因方面的研究与应用进行综述。

1 棉花转基因的主要方法和平台

植物遗传转化的研究早在20世纪60～70年代就已经开始了，包括农杆菌介导法、基因枪法、显微注射法、电击法、PEG法、超声波法等。发展到现在，棉花的转基因方法主要有3种：农杆菌介导法（Agrobactetium-mediated gene tansfer）、基因枪轰击法（particle bombardment）和花粉管通道法（pollen tube pathway）。

1.1 农杆菌介导法 农杆菌是普遍存在与土壤中的一种革兰氏阴性细菌，主要分为2大类：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。目前应用较多的是根癌农杆菌，被誉为“自然界最小的遗传工程师”[3]。根癌农杆菌的Ti质粒上有一段T-DNA区，人们将目的基因插入到改造后的T-DNA区，借助农杆菌的侵染能力，经过一系列过程，实现外源基因的转移和整合。该方法的受体材料主要包括：下胚轴、子叶、茎尖分生组织[4]、愈伤组织、胚性愈伤组织[5]和幼胚等。棉花的遗传转化常采用Ti质粒，以下胚轴为受体材料，导入与转化的成功率达到80%。1987年，Umbeck等[6]和Firoozabady等[7]首次报道了利用农杆菌介导法遗传转化棉花获得转基因植株，之后国内外在转基因组织培养再生体系的建立方面研究迅速并取得巨大进展[8-10]。目前在生产上应用的诸多转基因棉花品种都是通过该方法得到的[6]。

1.2 基因枪轰击法 基因枪轰击法又被称为粒子轰击技术（paticle bombardment）或高速微粒子发射技术（high-velocity micro-projectile），是继农杆菌介导法之后应用最广泛的一种技术。其主要原理是借助火药爆炸、高压放电或者高压气体驱动等作为动力，将载有外源基因的钨或金粉粒导入受体细胞，使其整合到受体基因组内进而得到表达。该方法转化棉花的靶受体广泛，包括愈伤组织、胚性悬浮细胞、茎尖分生组织、幼胚以及花粉等[11]；但是转化频率低，遗传稳定性较差[12]。1990年，Finer等[13]以棉花胚性悬浮细胞为受体最先通过基因枪轰击法遗传转化棉花并收获转基因植株。

1.3 花粉管通道法 植物授粉后，一些珠心细胞退化在珠孔和胚囊之间形成花粉管通道，将外源DNA涂于授粉后的受体作物的柱头上，或注射到其子房中，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期的胚胎细胞，并进一步整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵发育而成为转基因新个体[14]。主要操作方式有：微注射、花粉粒携带、柱头滴加和子房注入等[14]。该方法转化效率比较低，一般在2%左右，而且受环境及人为操作影响较大。不过操作简单并且可以直接获得转基因棉花种子，与常规育种结合，在选育高产、优质、多抗转基因棉花新品种中发挥了重要作用。目前，通过该方法得到的部分转基因抗虫棉品种（品系）已审定并在生产上大面积推广应用。

1.4 棉花规模化转基因技术体系平台 中国农科院棉花研究所李付广团队与国内相关研究单位合作，建立了以农杆菌介导法和花粉管通道法为主、基因枪法为辅的棉花高效转基因技术体系，并将植株嫁接技术成功应用于转基因苗的移栽，成活率高达90%，有效解决了再生苗成活率低的难题，年产转基因植株6 000株以上，初步实现了棉花转基因的规模化。进一步通过田间筛选、室内鉴定和分子检测对获得的转基因植株进行快速筛选，有针对性地系统开展安全性评价、生态区推广和新品种推广。

该技术体系将多种转基因技术进行了有效组装，实现了流水线操作，既提高了工作效率，又降低了经济成本。近年来。利用该技术体系累计为国内41家单位转化基因234个，创制种质材料621份，成功获得中棉所17、中棉所27、泗棉3号等16个转基因棉花新品种。至2005年，在冀、豫、鲁、皖、鄂、苏等6个产棉省累计推广国产转基因棉达409.62万hm2，社会经济效益达93.8亿元。该体系的建立对于促进我国棉花生物技术育种以及加速其产业化进程具有重要意义，处于国内同类研究的领先地位，已达到国际先进水平[15]。

1.5 棉花组织培养性状纯化及外源基因功能验证平台 中国农科院棉花研究所李付广团队将“棉花叶柄组织培养与高分化率材料选育方法（专利号：ZL200610089439.1）”和“一种棉花枝条扦插方法及其专用扦插生根剂（专利号：ZL200510088962.8）”两项专利技术结合，定向筛选出高分化率材料，并建立了稳定的组织培养体系。在此基础上，筛选出3类与该体系相适宜的高效转化载体，大大提高了转化效率。

“外源基因在棉花上快速功能验证的技术平台”年转化验证外源基因160余个。对156个候选基因进行转化验证的过程中，筛选出2 000余份富有利用价值的种质材料，865份稳定遗传的变异材料。对已获得的转基因材料充分利用，相继培育出中棉所50、中棉所47、中棉所52等24个新品种，其中12个通过国家审定，12个通过省级审定；进一步被引用后又衍生出20余个转基因棉花新品种/系，累计创造社会经济效益17.98亿元。

2 棉花全基因组测序

对于每个生物个体而言，基因组包含了其全部的遗传信息，利用测序技术破解基因组信息，是生物科学研究的重要手段。2007年，中国农业科学院棉花研究所联合深圳华大基因研究院、美国农业部南方平原研究中心等优势单位，率先在国际上启动了“棉花基因组计划”（Cotton Genome Project，CGP）。分别于2012年和2014年相继完成了二倍体雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）（D基因组）和二倍体亚洲棉（Gossypium arboreum L.）（A基因组）全基因组遗传图谱的绘制，相关论文均发表于国际权威学术期刊《自然-遗传学》（Nature Genetics）[16-17]。棉花基因组信息的获得，标志着我国棉花基因组学研究已取得了国际领先水平。为陆地棉（Gossypium hirsutum L.）和海岛棉（Gossypium barbadense L.）等四倍体基因组分析提供了信息基础，为阐明棉花起源与进化、揭示四倍体棉种形成机制、解析高产与优质的遗传机理、实现基因水平上的分子设计育种均具有重要意义。

3 应用于棉花的主要基因

目前应用于棉花育种的目的基因主要包括抗虫基因、抗除草剂基因、抗病基因、抗逆性基因和品质产量改良基因等。

3.1 抗虫基因 在我国，应用于棉花的抗虫基因主要有苏云金芽孢杆菌的内毒素蛋白基因（Bacillus thuringiensis，Bt）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI）和植物凝集素基因（lectin）。

Bt基因是研究最多、进展最快及应用最广泛的一类基因，它对鳞翅目昆虫具有专一杀伤作用，其种类很多，但是获得的转基因抗虫棉的Bt基因仅有少数几种，如Cry1A、Cry1A（b）、Cry1A（c）等[18]。CPTI基因是从豇豆中分离得到，其基因产物是一种约含80个氨基酸的小分子多肽，其通过抑制胰蛋白酶的活性来干扰昆虫的消化作用，使其得不到充足的影响，导致发育不良，最终死亡。CpTI基因对天峨类、夜蛾类、叶甲类及灰翅夜蛾类等多类害虫有广谱抗性。植物凝集素是一类能够特异性识别糖类物质并与之结合的活性球蛋白，对同翅目害虫如棉蚜虫有极强的抗杀作用。目前应用较多的主要有豌豆凝集素（P-lec）、雪花莲凝集素（GNA）和半夏凝集素（PTA），其中P-lec和GNA对害虫具有极强的抗杀作用，同时对人类几乎无毒害。

1991年，谢道昕等[19]在国内首次报道了将B.t.aizawai 7-29和B.t.kurstaki HD-1基因分别导入陆地棉品种。1998年，倪万潮等[18]将人工合成的Cry1A基因导入棉花，获得了高抗棉铃虫的转基因植株，是我国成为第二个独立成功研究转基因抗虫棉并拥有自主知识产权的国家。早期的抗虫棉采用单一抗虫基因，存在抗虫单一、害虫易产生耐受性等问题。1999年，郭三堆等[20]将人工合成的GFM Cry1A和经过修饰的CpTI的双价抗虫基因导入棉花，首次获得了高效双价转基因抗虫棉株系。郭洪年等[21]将Cry1Ac/API2B基因导入棉花，获得了抗棉铃虫90.0%～99.7%且农艺性状优良的9个双价抗虫棉纯合品系。我国双价抗虫棉的研制成功和大面积试种示范，对减少农药施用和保护环境，实现农业可持续发展具有巨大而深远的影响。

3.2 抗除草剂基因 棉田中杂草种类繁多，影响了棉花的正常发育，给生产造成严重干扰。将外源抗除草剂基因导入棉花，使棉株具备某种除草剂抗性意义重大。在我国，成功应用于棉花的抗除草剂基因有：抗草甘膦（glyphosate）基因、抗2，4-D单氧化酶基因（tfdA）和抗溴苯腈（bromoxyril）基因。

草甘膦是目前应用最为广泛的一种非选择性光谱除草剂，能够特异性的抑制植物和细菌体内莽草酸羟基乙烯转移酶（EPSPs）的活性。1995年，上海植物生理研究所首次通过辐射育种得到一个耐草甘膦的种质系，不过其抗草甘膦能力只有田间用药浓度的90%。祝水金等[22]筛选抗草甘膦突变体库获得稳定遗传的抗草甘膦种质系。刘锡娟等[23]、谢龙旭等[24]分别将抗草甘膦基因EPSPs和突变基因（aroAM12）导入棉花，获得对草甘膦给具有较强抗性的转基因棉。

2，4-D是一种非常稳定的激素型除草剂，通过干扰植物细胞分裂的速率达到除草目的，但其能被微生物体内的2，4-D单氧化酶所分解。棉花对2，4-D非常敏感，将外源的tfdA基因导入棉花后可大大提高棉花对2，4-D的抗性。1994年，陈志坚等[25]成功将tfdA基因导入晋棉7号，抗性试验表明，转基因后代可耐0.08%以上的2，4-D，超过一般大田施用浓度。郭宝生等[26]选育的抗2，4-D棉花新材料，同样也获得了良好的效果。

溴苯腈是一种触杀型除草剂，主要通过抑制植物光合作用过程中电子传递，使组织迅速坏死发挥除草作用。

3.3 抗病基因 棉花的整个生育过程中遭受多种病菌的侵害，其中以黄萎病和枯萎病这两种土传性真菌病害最为严重，尚无法根治，成为棉花生产的主要障碍。近年来，应用于棉花基因工程的主要有几丁质酶（CHI）、β-1，3-葡聚糖酶（Glu）和葡萄糖氧化酶（GO）等外源抗病基因。

几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶是植物防御体系中的两种防卫因子，两者之间存在协同增效作用。刘桂珍等[27]通过激光微束穿刺法将含有β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶基因的双价载体pLGC导入棉花幼胚，进而选育出对黄萎病具有较高抗性的转基因棉花株系。

葡萄糖氧化酶通过催化B2D2葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2，诱发植物的抗病反应，还可以作为第二信使诱导植株抗性系统形成。研究表明，转GO基因的棉花对黄萎病和枯萎病的抗性具有显著提高[28]。吴家和等[29]通过农杆菌介导法，将维管束特异启动子启动的几丁质酶和CaMV35S启动的β-1.3-葡聚糖酶嵌合双价基因导入棉花，获得3个双抗转基因纯合系。

3.4 抗逆性基因 盐碱、干旱、高低温和涝渍等对棉花的生长发育产生显著影响。近年来，围绕棉花抗盐碱、抗寒、、抗旱以及抗衰老等方面开展了一系列研究，并已取得一定进展。

沈法富等[30]将罗布麻DNA导入鲁棉后，转基因植株后代的抗盐性及抗枯萎病均有所提高。吕素莲等[31]将甜菜碱合成中关键酶胆碱脱氢酶基因betA和乙酰乳酸合成酶的突变基因als基因导入3个棉花优良品种中，转基因植株的耐盐性得到明显提高。异戊烯基转移酶基因（ipt）编码蛋白控制细胞分裂素的生物合成，在特异蛋白启动子控制下将其导入棉花，发现再生植株的根系更加发达[32]。将紫秆柽柳晚期胚胎发生丰富蛋白（LED）基因导入新陆早18号，在干旱胁迫诱导下，转基因棉表现出了优良的生长和生理优势，抗旱能力明显提高[33]。

3.5 优质高产基因 棉花纤维的强度、长度和细度等品质性状是评价棉花质量的重要标准，提高棉纤维品质是当前棉花育种工作的一个重点，转基因技术与常规育种相结合加速了纤维品质改良进程。

棉纤维特异启动子E6驱动兔角蛋白基因通过花粉管通道技术导入棉花，获得稳定遗传转基因株系，其纤维品质得到部分改良，尤其比强度得到大幅度提高[34]。黄全生等[35]将蜘蛛丝蛋白基因通过基因枪轰击进去海岛棉茎尖，得到强度高和韧性好的优质纤维。开花相关基因FAC基因最早发现于拟南芥，其含有两个RNA识别基序的结构域（RNA recognition motif，RRM）和一个WW蛋白质相互作用基序[36]。研究结果证明两个OsFCA-RRMs异位表达均能使细胞增大，产量提高，即在细胞大小调控中均发挥重要的的作用。Os-csRRM1和Os-csRRM2在植物中呈现非常高的进化保守性。序列比对分析还发现，它们与小麦、大麦、黑麦、蓖麻、葡萄和油菜具有极高的同源性，表明RRMs在不同植物中可能具有相似的功能[37-38]。Sun等[39]从油菜（Brassica napus）中克隆得到Bn-csRRM2基因，遗传转化棉花结果发现转基因棉花的花粉、子叶柄和棉纤维等多种类型的细胞增大，花、子房、子叶、叶片和萼片等器官变大以及整株变高，单铃重可达7.5g，纤维长度增加10%左右，产量与对照相比增幅范围为35%～66%。转FBP7：iaaM基因棉花衣分高达47%～50%，而非转基因对照仅为37%～40%；纤维产量提高了23%～34%；纤维细度也得到显著改善[40]。中棉所利用海岛棉优质渐渗系与转基因抗虫棉品系杂交、分子聚合技术培育出“中棉所70”，其纤维长度为32.5mm，达到了优质棉标准。

4 转基因棉花育种与应用

近年来，随着转基因技术的发展，从单一的农杆菌侵染到基因枪轰击、真空渗透等，棉花转基因方法和途径得到较大拓展。与此同时，伴随着基因克隆技术的发展，一些优良内源或外源基因不断得到克隆，为棉花转基因提供更多基因资源，也获得了一批又一批的转基因棉花，诸如各种转基因抗虫棉、抗病棉、抗逆境棉和转基因优质棉。其中，转基因抗虫棉在生产上已经得到大规模商业化推广和应用，获得了显著的经济效益、生态效益和社会效益。2000-2009年是我国转基因抗虫棉品种迅速发展的10a，期间共有383个品种通过国家或者省级审定，其中通过国家审定的有107个，安徽审定16个[41]。截至2014年，我国总计有149个转基因抗虫棉品种通过国家审定，其中安徽省品种有7个，包括国丰棉12、诺华棉1号、荃银2号、皖杂棉9号、金科棉98、绿亿航天1号、屯丰棉6号。安徽省审定的转基因棉花品种41个。我国转基因棉花种植面积已占到棉花总面积的近80%，长江、黄河流域棉区抗虫棉种植比例近100%，其中国产转基因抗虫棉市场占有率从1999年5%上升到2012年98%。

5 转基因棉花产业化相关的问题

5.1 转基因棉花的环境安全性 转基因棉花是我国种植的面积最大的转基因作物，人们看到商业化带来巨大经济利益的同时，也注意到其可能存在的潜在风险，其中生态安全问题已成为多方面关注的焦点。棉花环境安全的科学问题是：转基因棉花的杂草化趋势、基因漂移、靶标害虫对转基因棉花产生抗性、对土壤生物群落多样性影响等。针对这些安全性问题，我国已经制定一系列安全性评价法规并组建了转基因棉花环境安全风险分析与管理技术体系，形成了安全评价技术规范。

目前国际上对于转基因作物以及产品检测技术主要分为外源蛋白质测定和外源基因测定两类。常用的外源蛋白质检测方法有：试剂盒法、试剂条法、免疫印迹法（Western blot）和酶联免疫法（ELISA）等。外源基因检测技术主要分为定性检测和定量检测。定性检测技术主要以聚合酶链式反应（PCR）和探针杂交为基础，检测手段有：一般PCR、巢式PCR及核算印记法等。定量检测技术有：半定量PCR法和荧光定量PCR法等[42]。检测流程为：第一步，筛选判断是否含有转基因成分；第二步，确定转基因成分的性质；第三步，定量分析判定是否需要贴上识别标签。

5.2 抗虫棉种子真实性检测 目前，棉花品种鉴定仍以形态鉴定为主，同时参考同工酶和种子贮藏蛋白电泳图谱。但是形态标记受环境影响较大、周期长、工作量大，且同工酶和种子贮藏蛋白标记多态性不够丰富。分子标记技术从DNA水平成为棉种鉴定技术新的发展趋势。张小娟等[43]筛选获得52对核心引物，对92分陆地棉骨干种质和3份亚洲棉骨干种质进行多样性分析，揭示了不同种质间的遗传差异，为棉花品种区别和鉴定提供了技术支持。匡猛等[44]、王飞等[45]比较了应用于棉花品种鉴定的4种分子标记—RFLP、RAPD、AFLP和SSR，分析得出SSR标记具有很高的多态性，其优越性非常适用于品种鉴定研究和DNA指纹图谱的构建，为转基因抗虫棉种子真实性快速鉴定开辟新思路。寇伟等[46]利用卡那霉素处理探索出一个可以作为有效快捷的转基因棉花室内筛选方案。

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（责编：张长青）