miRNA－375在前列腺癌患者血清中表达的临床意义

俞俊杰，周广臣，王业华，吴银霞

（扬州大学临床医学院：1．泌尿外科，2．肿瘤科，江苏扬州 225001）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是西方国家男性生殖系最常见的恶性肿瘤，占男性恶性肿瘤死因的第2位［1］。在我国，随着人们生活生活方式和饮食结构的改变及社会人口老龄化的加剧，PCa的发病率及死亡率也呈逐年上升的趋势。近年来一类新的非编码基因miRNA的出现，为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。miRNA是一种广泛存在于真核生物中长度约18～22个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，它们通过转录后水平调控基因的表达从而参与了众多的生理和病理过程［2］。最近的研究表明在多种肿瘤患者及其对照组的血液中检测到的不同表达水平的miRNA［3－4］。目前已经证明肿瘤细胞中某些miRNA与癌症患者的预后相关［5］，由此推断血清中也存在类似的情况。为了了解PCa患者血液循环中的miRNA与PCa临床相关性，我们筛查了PCa组织与良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）组织的miRNA表达谱芯片，选取miRNA－375作为研究对象，探讨PCa患者血液中miRNA－375表达情况，为PCa的诊断及预后判断提供分子生物学依据。

1 资料与方法

1．1 主要材料与试剂主要试剂有miRNA3．0芯片（美国 Affymetrix），miRNA 提取试剂盒（miRNAeasy Mini Kit，Qiagen，德国），miRNA 逆转录试剂盒（宝生物工程有限公司，大连），实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Green PCR Master Mix（宝生物工程有限公司，大连）。miRNA－375（Bulge－LoopTM miRNA qRT－PCR Primer Kit）及内参U6引物购自广东锐博公司。

1．2 临床资料收集扬州大学临床医学院泌尿外科2008年01月至2015年05月的血清样本共110例，其中30例BPH患者，80例PCa患者；另外收集PCa及BPH手术切除新鲜组织标本各15份，予液氮保存备用，所有病例术前均未经内分泌治疗及放化疗处理。病理分级依据2003年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）前列腺癌病理组织学分类标准Gleason评分，肿瘤分期根据美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）的TNM进行分期。本研究方案通过扬州大学临床医学院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。1．3 miRNA表达谱芯片检测 实验步骤包括新鲜PCa及BPH组织样品总RNA抽提，RNA质检，Poly（A）Tailing，芯片杂交，芯片洗涤和扫描实验，数据分析等（由上海其明生物有限公司完成）。

1．4 血清及组织miRNA提取按照miRNAeasy Mini Kit试剂盒提供的步骤提取血清miRNA：①取血清400μL，加入5倍体积的QIAzol试剂，室温放置5min；②加入等体积氯仿，放置5min；③4℃、12 000r／min离心15min；④取上层水相300μL，加入1倍体积100%乙醇，充分混匀；⑤将混合液转移至Rneasy收集柱中，12 000r／min、室温下离心15s，弃废液；⑥向柱子加700μL Buffer RWT，12 000r／min、室温下离心15s，弃废液；⑦向柱子加500μL Buffer RPE，12 000r／min、室温下离心15s，弃废液；⑧重复步骤7；⑨将收集管连同收集到的液体一起扔掉，将柱子移入到一个新的2mL收集管内，盖上盖子，全速离心2min；○10用30μL去RNA酶水溶解RNA。置于－80℃低温冰箱备用。将PCa及BPH手术切除新鲜组织标本放入液氮内，经过研磨后加入QIAzol试剂，其余步骤同血清miRNA提取方法。

1．5 miRNA－375RT－qPCR反应首先反转录反应采用50μL反应体系进行实验，体系中包括5×反应缓冲液10μL，2．5nM dNTP Mix 4μL，RNA酶抑制剂1μL，反转录酶1μL，RNA模板2μg，加去RNA酶水至50μL。在PCR仪上设置反转录反应程序：42℃60min，70℃10min。RT－qPCR反应：反应体系包括：Taq酶、dNTP mix、SYBR Green I、Bulge－LoopTM miRNA RT－qPCR Primer Kit、反转录产物、去RNA酶水，反应条件：95℃20s，95℃10s，60℃20s，70℃5s，共40个循环。采用2－ΔCt法进行数据分析，通过qPCR检测样品中目的基因和内参基因的表达量，根据qPCR反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的域值循环数 （threshold cycle number，Ct值），采用△Ct的方法进行相对定量，△Ct＝（待测样品目的基因的Ct平均值—待测样本的内参基因的Ct平均值），每个样本设3复孔，U6为内参，根据熔解曲线分析PCR产物，排除引物二聚体干扰。BPH患者血液为校准样本，PCa患者血液为实验样本，分别计算△Ct值。2－ΔCt代表PCa与BPH患者血液中miRNA－375基因的相对表达量。

1．6 统计学处理采用SPSS17．0统计软件对实验数据进行统计分析，数据采用±s表示，两组间数据比较采用独立样本的双侧t检验分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 基因芯片检测PCa中miRNA的表达5例PCa和5例BPH手术切除新鲜组织标本的miRNA芯片差异表达谱见图1。miRNA表达差异通过倍数变化（差异倍数≥2倍）进行比较，结果显示：PCa组有35个miRNA发生显著变化，上调显著的有17个miRNA，其余18个miRNA发生显著下调，其中miRNA－375是在PCa中表达上调最明显的miRNA之一（图1）。

图1 芯片筛选前列腺癌、前列腺增生组织中的差异miRNA（部分）

2．2 miRNA－375在PCa、对照组血清及组织中的表达情况基因芯片发现miRNA－375在PCa组织表达上调，癌细胞中的miRNA能否释放进入血液中，我们将miRNA－375作为研究对象，用RT－qPCR技术检测PCa及BPH患者血液中的miRNA－375的表达情况。miRNA－375为目的基因，U6作为内参基因作数据的标准化处理。实时定量PCR结果表明，miRNA－375在PCa血液中的2－ΔCt＝18．63±3．05，在BPH血液中的2－ΔCt＝5．73±1．45，与BPH 组比较miRNA－375在PCa组中的表达水平明显升高，二者之间差异有统计学意义（P＜0．01）。另外我们收集PCa及BPH手术获得新鲜标本各15例，检测其中 miRNA－375 的 表 达 情 况，发 现 miRNA－375 在PCa组织中表达为10．70±1．82，而在BPH标本中表达量为5．47±2．09，两组比较差异具有统计学意义（P＜0．01，图2）。

2．3 血清miRNA－375表达与PCa临床病理参数的相关性将80例PCa样本按照年龄、TNM分期、Gleason评分、是否发生骨转移、血清PSA水平进行分组，然后分别统计各组中miRNA－375的表达情况。结果表明，≤60岁组与＞60岁组miRNA－375的表达量分别为18．71±2．36和20．52±3．30，差异无统计学意义（P＞0．05）。血清 miRNA－375表达水平与临床分期相关（P＜0．05），miRNA－375表达水平随着临床分期的增加而增加。在Gleason评分中，≤7组与＞7组miRNA－375表达水平不同，差异具有统计学意义（P＜0．05）。我们发现在具有骨转移的PCa患者的血液中miRNA－375表达水平明显高于无骨转移患者，差异有统计学意义（P＜0．05）。而miRNA－375表达量与PSA水平无关（P＞0．05，表1）。

表1 miRNA－375的表达与前列腺癌临床病理参数间的关系

图2 miRNA－375在前列腺癌、前列腺增生组织中的表达

3 讨 论

研究表明miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，近年来miRNA已经成为肿瘤标志物研究的热点。血清和血浆中的miRNA相当稳定，在不同物种和不同疾病中表现出特异性，并且可以被直接检测出来［6］。很多研究表明血液中的 miRNA能够作为PCa诊断和预测进展的标记物，如血液中的miRNA－21、miRNA－7、miRNA－221能预测去势抵抗性 PCa的进展，具有判断预后的价值［7－8］。因此血清中的miRNA可以作为PCa诊断及判断PCa进展的标志物。

我们分析了PCa及BPH组织中miRNA表达谱的差异，发现17个miRNA在PCa组织中高表达，其中miRNA－375在PCa表达明显较BPH组织高，进一步用RT－qPCR验证PCa及BPH组织中miRNA－375的表达情况，结果与基因芯片一致。这个结果提示血清中miRNA－375的高表达与PCa组织中miRNA－375之间有着潜在的联系。miRNA－375生物学功能强大，能够调控一系列基因的转录，控制细胞的生长、增殖［9－10］，并且参与了葡萄糖诱导的胰岛素分泌过程［11］。在肿瘤中miRNA－375以癌基因的身份出现，并且与多种肿瘤的转移及预后相关［12－13］。本研究应用RT－qPCR技术检测PCa、BPH患者血清中miRNA－375的表达差异，结果发现，与BPH对照组相比，miRNA－375在PCa血清中明显高表达。通过检测血清中miRNA－375的表达水平有助于提高PCa患者的早期诊断率，而且miRNA－375与PCa的病理分期、病理分级均有相关性。BRASE等［14］研究发现miRNA－375血清水平与PCa的淋巴结转移阳性率成正相关，我们研究发现骨转移患者血清中miRNA－375的表达量显著高于无骨转移患者。研究结果提示，血清miRNA－375可作为PCa非侵入性诊断和预后的分子标志。HUANG等［15］研究发现血清中的miRNA－375和 miRNA－1290能够预测去势抵抗性PCa患者生存期，血液中 miRNA－375和 miRNA－1290高表达，去势抵抗性PCa患者的生存期将缩短。我们推测miRNA－375可能与雄激素的作用机制方面存在一定的联系，然而目前关于这方面的研究甚少，后期我们将就血清miRNA－375对去势抵抗性PCa的影响机制进行更为深入的研究，为临床提供更加充分的分子生物学依据。

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