云南松松塔多糖含量测定两种方法的比较

王莹，张海珠，*，刘熙，李杨（.大理学院药学与化学学院，云南大理67000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理67000）

云南松松塔多糖含量测定两种方法的比较

王莹1，2，张海珠1，2，*，刘熙1，2，李杨1
（1.大理学院药学与化学学院，云南大理671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000）

摘要：通过对云南松松塔中多糖的含量的测定，比较硫酸-蒽酮和硫酸-苯酚两种常用多糖测量方法。通过精密度试验、稳定性试验、回收率试验等方面，对硫酸-蒽酮和硫酸-苯酚两种常用多糖测量方法进行比对。结果表明：硫酸-苯酚法在云南松松塔多糖含量测定中较硫酸-蒽酮法优越，硫酸-苯酚法测定云南松松塔多糖含量时，操作简便，精密度、稳定性高，为云南松松塔等植物的多糖含量测定提供了参考。

关键词：云南松；松塔；硫酸-苯酚法；硫酸-蒽酮法；多糖含量

松塔（Pinecone）系松科（Pinaceae）松属（Pinus）植物的球果，别名松果、松球，其植物来源有华山松、云南松、红松、油松及思茅松等[1]，松塔具有祛痰、止咳、平喘等功效[2]，而分布在云南的云南松（Pinusyunnanensis Faranch）资源十分广泛，但药用价值却未得到有效地开发利用。本文对采集于云南省大理市的云南松松塔进行研究，测量其多糖含量，为云南松松塔的药用价值的开发利用奠定基础。

1　材料

1.1研究对象

云南松松塔样品于2013年8月采集于云南省大理市斜阳峰，标本由大理学院段宝忠副教授鉴定，粉碎，过60目筛，置于阴暗处备用。

1.2主要仪器

RE-3000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；AL104电子分析天平：梅特勒一托利多仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京浦西通用仪器有限责任公司；恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂。

1.3主要试剂

葡萄糖：国药集团化学试剂有限公司，纯度≥99%，批号20130408；蒽酮：国药集团化学试剂有限公司，纯度≥99%，批号20131011；苯酚、浓硫酸及其他试剂均为分析纯。

2　方法

2.15%苯酚溶液的配制

精密称取苯酚10 g，加入200mL水溶解，完全溶解后放置于棕色瓶保存，备用。

2.2硫酸-蒽酮溶液的配制

精密称取蒽酮4mg，加入80%200mL硫酸溶解，完全溶解后放置于棕色瓶保存，备用。

2.3标准溶液的配制

精密称取葡萄糖50.00mg，置于50mL容量瓶溶解，定容，得1.0mg/mL标准溶液，备用。

2.4样品溶液的配制

精密称取样品10mg，置于50mL容量瓶溶解，定容，得样品溶液，备用。

2.5测量波长的选择。

2.5.1硫酸-蒽酮法

精密移取1.0mg/mL标准溶液/样品溶液各1mL，分别置于两个10mL容量瓶中，各加入7mL硫酸-蒽酮溶液，冷却至室温后定容，再次冷却至室温，100℃沸水浴加热10min，冷却至室温，另取1mL蒸馏水以同样方法做空白对照，进行光谱扫描，扫描波长500nm～700 nm[3]。图1显示得到，测量波长为622 nm。

图1　样品溶液与葡萄糖溶液的紫外吸收光谱（硫酸-蒽酮法）Fig.1　TheUV absorption spectra ofsam ple solution and glucose solution（sulfuric acid-anthronemethod）

2.5.2硫酸-苯酚法

精密移取1.0mg/mL标准溶液/样品溶液各1mL，分别置于两个10m L容量瓶中，各加入5%苯酚溶液1mL，5mL浓硫酸，冷却至室温后定容，再次冷却至室温，100℃沸水浴加热10min，冷却至室温，另取1mL蒸馏水以同样方法做空白对照，进行光谱扫描，扫描波长400 nm～550 nm[4]。图2显示得到，测量波长为490 nm。

图2　样品溶液与葡萄糖溶液的紫外吸收光谱（硫酸-苯酚法）Fig.2　TheUV absorption spectra ofsam ple solution and glucose solution（sulfuric acid-phenolm ethod）

3　结果与分析

3.1标准曲线的制备

3.1.1硫酸-蒽酮法标准曲线的制备

精密吸取葡萄糖标准溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1mL置于10mL容量瓶中，加入7mL硫酸-蒽酮溶液，冷却至室温后定容，再次冷却至室温，100℃沸水浴加热10min，冷却至室温，另取1mL蒸馏水以同样方法做空白对照，进行光度测量，测量波长为622 nm。以吸光度A为纵坐标Y，以溶液浓度C为横坐标X，得到标准曲线Y=16.177X-0.075 3，相关系数R2=0.999 6。测定结果显示，葡萄糖在10μg/m L～110μg/m L范围内线性关系良好。

3.1.2硫酸-苯酚法标准曲线的制备

精密吸取葡萄糖标准溶液0.25、0.75、1.25、1.75、2.25mL置于10mL容量瓶中，1mL 5%苯酚溶液，5mL浓硫酸，冷却至室温后定容，再次冷却至室温，100℃沸水浴加热10min，冷却至室温，另取1m L蒸馏水以同样方法做空白对照，进行光度测量，测量波长为490 nm。以吸光度A为纵坐标Y，以溶液浓度C为横坐标X，得到标准曲线Y=2.06X+0.032 8，相关系数R2= 0.999 7。测定结果显示，葡萄糖在10μg/mL～90μg/mL范围内线性关系良好。

3.2方法学考察

3.2.1硫酸-蒽酮法方法学考察

精密度试验结果RSD=0.64%。

精密移取样品溶液1mL，按照2.5.2方法进行操作，得到重复性试验结果，得样品中多糖含量的平均含量为549μg/g，结果RSD=2.91%。

稳定性试验，每隔4 h测定样品液，连续考察24 h，RSD=1.67%。硫酸-蒽酮法加样回收率试验结果如表1所示。

表1　硫酸-蒽酮法加样回收率试验结果Table1　The resultsofaverage recovery ofsulfuric acid-anthrone m ethod

由表1可知，回收率试验显示，所测样品回收率平均值为99.68%，RSD=1.05%。

3.2.2硫酸-苯酚法方法学考察

精密度试验结果RSD=0.28%。

精密移取样品溶液1mL，按照2.5.2方法进行操作，得到重复性试验结果，得样品中多糖含量的平均含量为584μg/g，结果RSD=1.51%。

稳定性试验，每隔4 h测定样品液，连续考察24 h，RSD=1.14%。

硫酸-苯酚法加样回收率试验结果如表2所示。

表2　硫酸-苯酚法加样回收率试验结果Table2　The resultsof average recovery of sulfuric acid-phenol m ethod

由表2可知，回收率试验显示，所测样品回收率平均值为99.57%，RSD=1.43%。

综上所述，通过对精密度试验、重复性试验、稳定性试验、回收率试验等的考察，对比了硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法两种常用多糖测定方法。试验结果表明，硫酸-苯酚法所测云南松松塔多糖精密度、重复性、稳定性较好，虽然回收率较硫酸-蒽酮法略有不足，但相差不是很大，是目前测定云南松松塔多糖较为理想的方法。

3.3样品含量测定

用硫酸-苯酚法对松塔多糖样品进行测定，依照2.5.2方法进行操作，测得云南松松塔多糖粗提物的含量为58.41%。

4　讨论

1）硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法在测定松塔多糖的过程中，回收率试验方面，硫酸-苯酚法虽较硫酸-蒽酮法略有不足，但精密度、重复性、稳定性较好，操作简单，适合松塔及其制品的多糖含量常规测定。

2）硫酸-蒽酮法测量多糖含量的关键在于，蒽酮在空气中易氧化变质，因此蒽酮溶液应现配现用[5]，而硫酸-苯酚法在于苯酚的重结晶，去除其中被氧化的的醌类杂质，以提高实验准确性[6]。

利用硫酸-苯酚法测定松塔多糖的方法，所需仪器简单，药品价格低廉，操作简便，利于推广，对于云南松松塔多糖的药用价值的开发利用奠定基础。

参考文献：

[1]严文静,李春艳,杨永寿,等．不同采摘时间云南松松塔中脱氢枞酸的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志,2013,44(8):798-800

[2]周明波,刘光明,吕永俊,等．药用植物松塔的化学成分研究[J].大理学院学报,2008,10(7):1-4

[3]谭敏,邱细敏．白术多糖含量两种测定方法的比较[J].现代中药研究与实践,2012,26(2):73-75

[4] 周萍,罗延梦,马媛,等．核桃壳多糖的含量测定[J].安徽农业科学, 2012,40(25):12654-12655

[5]谭敏,邱细敏,陆艳艳,等．植物多糖分析方法综述[J].食品科学, 2009(21):420-423

[6]徐斌,董英,林琳,等．改良苯酚-硫酸法测定苦瓜多糖含量[J].食品科技,2005(7):79-82

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.038

收稿日期：2014-06-03

基金项目：国家自然科学基金（81260632）；云南省教育厅重点项目（云南松松塔多糖的分离纯化及免疫活性研究）；大理学院应用开发科研基金（KYYY201304）

作者简介：王莹（1981—），女（汉），讲师，在读博士，研究方向：主要从事中药活性研究。

*通信作者：张海珠，讲师,主要从事中药及天然药物活性及质量控制研究。

Com parison of Two M ethods of Determ ination in the Pinecone of Pinus yunnanensis

WANGYing1，2，ZHANGHai-zhu1，2，*，LIUXi1，2，LIYang1
（1.College of Pharmacology，DaliUniversity，Dali671000，Yunnan，China；2.Yunnan Provincial Key LaboratoryofEntomological BiopharmaceuticalR&D，Dali671000，Yunnan，China）

Abstract：Determination of the content in the cloud Nansongsongta polysaccharides，more sulfuric acidanthrone and sulfuric acid-phenol two common polysaccharidemeasurementmethod.By aspects of precision test，stability test，recovery testofsulfuric acid，sulfuric acid-anthrone and sulfuric acid-phenol two common polysaccharidemeasurementmethodswere compared.Sulfuric acid-phenolmethod in the determination of the polysaccharide content cloud Nansongsongta than sulfuric acid-excellent anthrone method.Sulfuric acid-the determination of the polysaccharide content cloud Nansongsongta phenol method，simple operation，high precision，stability，and other plants for the determination of the cloud Nansongsongtapolysaccharide content to provide a reference.

Key words：Pinus yunnanensis Faranch；pinecone；sulfuric acid-phenol method；sulfate acid-anthrone method；polysaccharide content