溪黄草多糖的微波提取及其抗氧化性研究

许丽丽，沈楚椰（韩山师范学院化学与环境工程学院，广东潮州521041）

溪黄草多糖的微波提取及其抗氧化性研究

许丽丽，沈楚椰
（韩山师范学院化学与环境工程学院，广东潮州521041）

摘要：研究微波法提取溪黄草多糖的最佳工艺条件并测定其抗氧化活性。通过单因素试验和正交试验优化提取条件，对溪黄草多糖还原能力及清除H2O2能力进行测定。结果表明，溪黄草多糖的最佳提取条件为：微波功率480W、微波时间75 s、料液比1∶35（g/m L）、浸提次数2次，此条件下多糖得率为12.07mg/g，溪黄草多糖具有良好的抗氧化活性。该法操作便捷，耗时少，条件温和，为溪黄草资源开发利用提供理论参考。

关键词：溪黄草；多糖；微波提取；抗氧化活性

溪黄草[Rabdosia serra（Maxim.）Hara]，别名溪沟草、山羊面等，为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜的全草，盛产于我国广东、广西等省区。溪黄草具有清热利湿、退黄、凉血散瘀等功效，是一种常见的民间草药，其水提物常用于治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎伴黄疸者、急性肝炎、肠炎和痢疾等[1-4]。目前已经开发出多种以溪黄草为主要原料的保健品如溪黄草冲剂、溪黄草袋泡茶等，但决定溪黄草功效的主要化学成分仍有待深入研究[5]。溪黄草多糖作为溪黄草水提物的主要成分之一，可能也是溪黄草药效的关键成分，但目前对其研究甚少。本试验利用微波提取法省时、高效、溶剂耗量少等优点[6-7]，将微波技术应用于提取溪黄草多糖并测定提取物的抗氧化活性，为溪黄草的药理研究和深度开发利用奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

溪黄草购于潮州市的环城西路诊所，60℃烘干、粉碎、过40目筛，经石油醚（60℃～90℃）回流脱脂2次（1 h/次），再用80%乙醇回流除杂2次（1.5 h/次）。然后烘干至恒重，置于干燥器中备用。

1.2仪器与试剂

WD800B型格兰仕微波炉：顺德市格兰仕电器实业有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、三氯甲烷、正丁醇等均为国产分析纯试剂。

1.3试验方法（平行试验3次，取平均值）

1.3.1溪黄草多糖提取工艺流程

微波提取→趁热减压抽滤→滤液浓缩至1 m L～3 mL→加4倍量95%乙醇充分搅拌→4℃冷藏静置3 h→离心15min（3 000 r/min）→沉淀用95%乙醇洗涤→savage法除蛋白[8]→过滤→适当稀释后进行多糖含量测定。

1.3.2溪黄草多糖含量的测定

1.3.2.1标准曲线的绘制[9-10]

准确称取葡萄糖（105℃烘干至恒重）0.104 9 g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，摇匀得葡萄糖储备液。取储备液0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10mL于10mL比色管中，定容，得浓度分别为0.010 49、0.031 47、0.052 45、0.073 43、0.094 41，0.115 39mg/m L的系列标准溶液。取标准液各1mL于试管中，加入1mL 5%苯酚（重蒸）溶液混合后，迅速加入5mL浓硫酸，混匀后静置5min，沸水加热15min，取出后用自来水冷却至室温，在490 nm处测吸光度。取1mL蒸馏水代替储备液做空白。以标准液的浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

1.3.2.2多糖含量的测定

取经稀释的溪黄草多糖溶液1mL，按1.3.2.1所述方法测定吸光度A。根据回归方程计算多糖的含量。式中：c为标准曲线上查得的葡萄糖浓度，mg/mL；V为溪黄草多糖溶液稀释后的总体积，m L；W为提取多糖时称取的溪黄草质量，g。

1.3.3试验设计（平行试验3次，取平均值）

溪黄草多糖提取的单因素试验：固定其它条件，分别考察微波功率、微波时间、料液比和提取次数对溪黄草多糖得率的影响。每次称取约1.0000 g干燥的溪黄草样品，先在料液比1∶30（g/mL），微波时间为60 s，微波功率分别为160、320、480、640、800W的条件下提取1次，研究微波功率对榕须多糖得率的影响。接着在初定最佳功率，料液比1∶30（g/mL），微波时间分别为30、60、90、120、150s的条件下各浸提1次，研究微波时间对榕须多糖得率的影响。再在初定最佳功率和时间，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/m L）的条件下各浸提1次，根据其多糖得率选择最佳料液比。最后在初定最佳功率、时间和料液比的条件下，研究提取次数（1次～4次）对多糖得率的影响。

正交试验设计：在单因素试验的基础上，每个因素选取3个水平，按照4因素3水平进行L9（34）试验。正交试验数据处理，采用直观分析方法，以极差大小确定因素主次顺序。

1.3.4抗氧化性的测定

1.3.4.1还原能力的测定

在1.25m L pH6.6的磷酸盐缓冲液中加入溪黄草多糖样品液1.25mL，1%的铁氰化钾溶液1.25mL，混合物在50℃恒温20min，再加入1.25mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3 000 r/min离心分离10min，取上清液2.5mL加蒸馏水2.5mL和0.1%FeCl3溶液0.5mL，在700 nm处测定吸光度[11-12]。以同浓度的VC和硫脲水溶液作对照。

1.3.4.2清除H2O2能力的测定[13]

用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制10mmol/L的H2O2溶液，取2.5mL上述溶液加入2.5mL溪黄草多糖的样品液。混匀后在248 nm处测得的吸光度为A1，试验中以不加样品液的H2O2溶液吸光度为A0，以不加H2O2的样品溶液吸光度为A2。则H2O2清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

2　结果与分析

2.1标准曲线

按1.3.2.1所述方法绘制葡萄糖标准曲线并进行线性拟合，得其线性回归方程为：y=8.7584x+0.029 0，式中x表示葡萄糖的浓度c（mg/mL），y表示吸光度A。线性相关系数R2=0.9991，即葡萄糖含量在0.010 49mg/m L～0.115 39mg/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系。

2.2单因素试验结果

2.2.1微波功率的影响

微波功率对溪黄草多糖得率的影响如图1所示。

图1　微波功率对多糖得率的影响Fig.1　Effectsofm icrowave power on the yield of polysaccharides

溪黄草多糖得率先是随着微波功率的增大而明显增加，这是由于微波功率增大，浸提液的温度快速提升，有利于溪黄草多糖较快地扩散到溶剂中。但当微波功率大于480W，溪黄草多糖得率降低。可能是由于萃取功率过高导致局部温度过高破坏了多糖的结构。因此，微波功率初步确定为480W。

2.2.2微波时间的影响

微波时间对溪黄草多糖得率的影响见图2。

图2 微波时间对多糖得率的影响Fig.2　Effectsofm icrowaveextraction tim e on the yield of polysaccharides

由图2可知，溪黄草多糖得率先是随着微波时间的增加而增大，当微波时间在60 s时，提取效果最好。当微波时间超过60 s，溪黄草多糖得率反而有所下降，这是由于开始时微波时间的增加有助于溪黄草多糖完全溶出，但当加热时间过长则会导致多糖结构受到破坏。因此初步确定微波时间为60 s。

2.2.3料液比的影响

料液比对溪黄草多糖得率的影响见图3。

图3　料液比对多糖得率的影响Fig.3　Effectsofsolid-liquid ratio on theyield of polysaccharides

料液比为1∶40（g/mL）时达到峰值，提取溶剂过少会导致溪黄草多糖与水之间的浓度差过小，不利于多糖的充分浸出。而提取溶剂过多，溶液不易达到有效的浸提温度，而且会增加提取液后期的浓缩和纯化时间，从而不利于多糖的提取。所以，初步选择1∶40（g/mL）作为最佳料液比。

2.2.4浸提次数的影响

浸提次数对溪黄草多糖得率的影响如图4所示。

溪黄草多糖的提取量随浸提次数的增加而增大，但提取2次以后多糖得率增加已经不太明显。若以4次浸提多糖得率作为溪黄草多糖总含量，则浸提2次，多糖提取量已达到93%，所以初步确定提取2次为宜。

图4　浸提次数对多糖得率的影响Fig.4　Effectsof extraction timeson theyield ofpolysaccharides

2.3正交试验

通过单因素试验初步确定提取溪黄草工艺条件为功率480W、时间60 s、料液比1∶40（g/mL）、浸提次数2。在此基础上设计因素水平表进行L9（34）试验，正交试验结果见表1。

表1　正交试验设计与结果Table 1　Designm ent and resultsofor thogonalexperiment

由极差R分析可知，影响多糖得率的各因素主次顺序为：微波功率>浸提次数>料液比>微波时间，最优组合为A2B3C1D2，正好为正交中的6号试验，该条件下多糖得率为12.07mg/g。故最优条件为微波功率480W、微波时间75 s、料液比1∶35（g/m L）、浸提次数2次。

2.4溪黄草多糖溶液的抗氧化性

2.4.1溪黄草多糖的还原能力

铁氰化钾能被还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾在酸性条件下能与三氯化铁反应生成普鲁士蓝（λmax= 700 nm）[12]。故吸光度越大，反映溪黄草多糖还原能力越强。溪黄草多糖的还原能力如图5所示。

图5　3种溶液的还原能力Fig.5　Reducing power of three solutions

在测定的浓度范围内，溪黄草多糖溶液、VC和硫脲溶液的还原能力均随浓度的增大而线性增强，线性拟合方程如下：溪黄草多糖提取液y=5.379 9x+0.150 5 （R2=0.985 7）；VC溶液y=11.768 8x-0.020 5（R2=0.995 3）硫脲溶液y=4.089 3x+0.042 8（R2=0.968 6）。三者还原能力的强弱顺序是：VC溶液>溪黄草多糖提取液>硫脲溶液。

2.4.2溪黄草多糖清除H2O2的能力

为了避免样品本身的紫外吸收影响测定结果，本试验以不加H2O2的样品吸光度为空白，按照试验方法测定吸光度，并计算清除率，溪黄草多糖清除H2O2的结果如图6所示。

图6　3种溶液对H2O2的清除率Fig.6　Removing H2O2capacity of threesolutions

在测定的浓度范围内，3种溶液对H2O2的清除率均随浓度的增大而增加，VC和硫脲清除H2O2的能力较接近，溪黄草多糖提取液也显示出一定的清除H2O2能力，但比VC和硫脲的清除能力弱。

3　结论

微波法提取溪黄草多糖的最优条件为：微波功率480W、微波时间75 s、料液比1∶35（g/mL）、浸提次数2次，此条件下多糖得率为12.07mg/g。作为水提物主要成分之一的溪黄草多糖具有良好的抗氧化活性，具有开发为功能性食品的潜力，而目前对溪黄草的开发利用仅局限于其水煎煮粗提物的使用。总之，溪黄草具有广阔的药品、食品和保健品开发前景，有关溪黄草的各项研究有待进一步深入。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.018

收稿日期：2014-04-01

作者简介：许丽丽（1982—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：分离科学与技术。

Study on the M icrowave Extraction and An tioxidant Activities of Polysaccharides from Rabdosia serra（M axim.）Hara

XU Li-li，SHENChu-ye
（College ofChemistryand Environmental Engineering，Hanshan NormalUniversity，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

Abstract：The optimum extraction conditionsand antioxidantactivitiesofpolysaccharides from Rabdosia serra （Maxim.）Hara was studied.The extraction conditions were optimized by the single factor experiments and orthogonal experiments.Then the antioxidantactivities of polysaccharideswere determined by the experiments of reducing capacity and removing H2O2capacity.Results indicated that the bestextracting conditionswere as follows：microwave power 480W，treatment time 75 s，ratio ofmaterial to solventwas 1∶35（g/mL）and extraction 2 times.Under this condition，the extraction rate of polysaccharides was 12.07 mg/g.The extracts showed obviousantioxidantactivities.Thismethod was simple，time-saving，undermild conditions.It provides ascientific basis for the exploitation and utilization of Rabdosia serra（Maxim.）Hara.

Keywords：Rabdosiaserra（Maxim.）Hara；polysaccharide；microwave extraction；antioxidantactivity