复合抑制剂对酪氨酸酶反应动力学的影响

王庆华，何云，王晓艺（.广东药学院基础学院，广东广州50006；.广东药学院中药学院，广东广州50006）

复合抑制剂对酪氨酸酶反应动力学的影响

王庆华1，何云2，王晓艺2
（1.广东药学院基础学院，广东广州510006；2.广东药学院中药学院，广东广州510006）

摘要：采用L-多巴氧化法分别研究了肉桂酸、壬二酸和4-己基间苯二酚两两复合对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用。Lineweaver-Burk图形分析表明，壬二酸和4-己基间苯二酚属于竞争性抑制剂，肉桂酸属于非竞争性抑制剂。两种竞争性抑制剂复合（壬二酸和4-己基间苯二酚）的直线相交于纵轴上同一点，而一种竞争性和一种非竞争性抑制剂复合（肉桂酸和壬二酸、肉桂酸和4-己基间苯二酚）得到的直线相交于第二象限，但不交于同一点。用King-Altman方法推导复合抑制剂对酶作用的反应速率方程，从理论上分析了上述两种类型的复合抑制剂Lineweaver-Burk直线的特点，得出的结果与试验结果一致。

关键词：酪氨酸酶；复合抑制剂；动力学；壬二酸；4-己基间苯二酚；肉桂酸

酪氨酸酶可逆性抑制剂广泛应用于医药、临床检测、食品加工、环境监测等多个领域[1]，而且越来越多的研究人员从在植物提取物中寻找酪氨酸酶抑制剂[2-4]，在一些研究工作和生产实践过程中，往往存在多个抑制剂同时作用于酪氨酸酶的情况，如植物提取物、复方药物制剂或食品、化妆品的复合配方中，发挥功能作用的酶抑制成分常常不局限于一种，还可能涉及两种甚至多种抑制剂复合作用[5-10]。若简单地以粗提取物（混和物）对酶抑制作用的Lineweaver-Burk图判定抑制剂的类型，并不能很好地反映多种抑制剂共同作用于同一酶靶点的情况，甚至可能会得到错误的结论。King-Altman方法运用图形辅助来推导复杂酶反应动力学方程，可简化推导过程[11]。本文以常见的酪氨酸酶可逆抑制剂肉桂酸、壬二酸、4-己基间苯二酚两两混合，从复合抑制剂对酶活性抑制试验和酶作用速率方程推导分析两个方面，探讨两种可逆抑制剂复合对酪氨酸酶二酚酶作用的动力学特点。

1　材料和方法

1.1材料

蘑菇酪氨酸酶（845U/mg）：Worthington公司；L-多巴：广州菲博生物科技有限公司；壬二酸（99%）、肉桂酸（99%）、4-己基间苯二酚（99%）：上海阿拉丁公司；DMSO：sigma公司。

752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；HH-1型电子恒温水浴锅。

1.2方法

1.2.1酪氨酸酶二酚酶活性测定

在10m L试管中加入1m L L-多巴（1.0mmol/L），3.8mL pH6.8的PBS溶液，充分混匀，于30℃水浴中保温10min后，加入酶液0.2mL（634U/mL），混匀，测定反应开始2min时在475 nm处的吸光度A，以吸光值A每分钟增加0.001为1个酶活力单位。

1.2.2抑制剂对酪氨酸酶活性的影响

加入各种不同浓度的抑制剂，保持酶量和反应溶液总体积5.0mL不变，按1.2.1方法测定抑制剂存在下不同底物浓度对酪氨酸酶二酚酶活性的影响。各种抑制剂均以DMSO溶解后配制，两种抑制剂复合的比例是根据试验测得的每种抑制剂单独作用时的半抑制率浓度IC50之比确定。

2　结果

2.1单一抑制剂对酪氨酸酶活性抑制作用

肉桂酸、壬二酸、4-己基间苯二酚对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用Lineweaver-Burk图，见图1。

图1　单一抑制剂对酪氨酸酶催化L-多巴活性抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.1　Lineweaver-Burk p lots for inhibition on theoxidation of LDOPA by tyrosinase

不同浓度的壬二酸、4-己基间苯二酚的Lineweaver-Burk直线交于纵轴同一点，最大反应速率Vmax不变，Km随抑制剂浓度增大而增大，属于竞争性抑制剂；而不同浓度肉桂酸的Lineweaver-Burk直线交于横轴同一点，Km值不变，Vmax随抑制剂浓度增大而减小，是酪氨酸酶二酚酶的非竞争性抑制剂，实验结果与以往文献报道[12-14]一致。

2.2复合抑制剂对酪氨酸酶活性抑制作用

复合抑制剂对酪氨酸酶二酚酶作用的Lineweaver-Burk图，见图2。

图2　复合抑制剂对酪氨酸酶催化L-多巴活性抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.2　Lineweaver-Burk p lots for inhibition of com posite inhibitor on theoxidation of L-DOPA by tyrosinase

一定比例复合的壬二酸和4-己基间苯二酚复合抑制剂的Lineweaver-Burk图的各直线交于纵轴上的同一点，与单一竞争性抑制剂的图形类似，见图2a′；而肉桂酸与壬二酸、肉桂酸与4-己基间苯二酚分别按一定比例复合，复合抑制剂浓度越大，直线斜率越大，不同浓度的复合抑制剂直线的交点都位于第二象限，不在同一点，见图2 b′、c′。

3　讨论

单一抑制剂的酶抑制动力学Lineweaver-Burk直线都交于同一点：竞争性抑制剂交于纵轴，非竞争性抑制剂的交于横轴，混合型抑制剂的交于第二象限。与单一成分抑制剂的Lineweaver-Burk直线交于同一点的情形不同，肉桂酸（非竞争性）和壬二酸（竞争性）复合共同作用于酪氨酸酶的Lineweaver-Burk直线都不交于同一点，肉桂酸（非竞争性）和4-己基间苯二酚（竞争性）复合共同作用于酪氨酸酶的Lineweaver-Burk直线亦显示同样实验结果。壬二酸和4-己基间苯二酚是两种竞争性抑制剂复合，其Lineweaver-Burk图形与单一竞争性抑制剂的类似，各直线都交于纵轴上同一点。在此可推导两种竞争性抑制剂及一种竞争性抑制剂和一种非竞争性抑制剂复合作用于同一个酶的反应速度方程，并分别讨论这两种情况的复合抑制剂动力学特点。

3.1两种竞争性抑制剂复合对酪氨酸酶活性的抑制作用

因为竞争性抑制剂结合在酶的活性中心，所以两种竞争性抑制剂就不能同时与酶结合。图3为两种竞争性抑制剂共同作用的酶反应方程。

图3　两种竞争性抑制剂共同作用的酶反应机制Fig.3　M echanism of enzym ic catalytic reaction for two com petitive inhibitors

两种不同的竞争性抑制剂I1、I2同时与酶作用。图中[S]是底物浓度，[I1]、[I2]是抑制剂浓度，Km为米氏常数，Ki为抑制剂、或底物、或中间复合物反应平衡常数，ki为相应的反应速率常数。用King-Altman法推导酶反应速度方程，其King-Altman图形见图4。

图4　两种竞争性抑制剂复合作用酪氨酸酶的各种存在形式和k乘积Fig.4　Each enzyme form sand k productof two com petitive inhibitorson tyrosinase

以下是反应速率方程的推导过程，式中v代表酶催化反应的速率，Vmax是最大反应速率。

Lineweaver-Burk方程为：

Lineweaver-Burk图的纵轴截距1/Vmax不变，表观Km为

。设[I]为两种抑制剂混合的总浓度，[I1]：[I2]=α，则[I]=[I1]+[I2]，[I1]=α[I2]。

表观Km则等于可看作复合抑制剂表观抑制常数。若KI≤K，可以证明KI≤K.I≤K，

1I21I2即K.I介于KI1和KI2之间。

3.2一种竞争性抑制剂I1和一种非竞争性抑制剂I2对酶的抑制作用

I1和I2结合在酶的不同位点，因此可以同时与酶结合，其反应式见图5。

图5　一种竞争性和和一种非竞争性抑制剂共同作用的酶反应机制Fig.5　M echan ism of enzym ic catalytic reaction for one competitive inhibitor and onenoncom petitive inhibitor

在用稳态处理时，推导酶作用速度方程的过程非常复杂，而用快速平衡态的处理方法相对简单，ES分解为产物P属慢反应，快速达到平衡时可忽略。King-Altman矢量图参考文献许根俊《酶的作用原理》[11]，略去推导酶促作用速度方程的详细过程。

为求不同抑制剂浓度的Lineweaver-Burk图各直线的交点坐标，可列方程组：

由上述推导的两种抑制剂复合作用的酶反应速率方程分析可知，两种竞争性抑制剂复合共同作用于酶，与单一竞争性抑制剂的图形一样，不同抑制剂浓度的酶动力学Lineweaver-Burk直线纵轴截距不变，横轴截距小于0，交点位于纵轴上的同一点，说明两种竞争性抑制剂复合作用，不改变酶促反应的最大反应速率Vmax，但表观Km值增大，复合抑制剂表观介于两种抑制剂的抑制常数K.I之间。据此可以解释实验中壬二酸和4-己基间苯二酚复合对酪氨酸酶二酚酶作用，与单一竞争性抑制剂具有相似的Lineweaver-Burk图形。一种竞争性和抑制非竞争性抑制剂复合，交点横轴坐标1/[S]小于0，纵轴坐标1/v大于0，交点位于第二象限，且交点位置与[I1]、[I2]相关，表观Km增大，Vmax减小。若I1、I2以一定比例混和，[I]越大，[I1]、[I2]越大，直线斜率越大，不同[I]浓度的一簇直线不交于一点，但各交点都位于第二象限，与单一抑制剂的图形不一样，见表1所示。据此则可解释实验中肉桂酸和壬二酸、肉桂酸和4-己基间苯二酚这类由一种非竞争和一种竞争性抑制剂复合对酪氨酸酶作用的Lineweaver-Burk图形。由此可见，对于成分复杂的混合物，单从Lineweaver-Burk图无法确定究竟是单一成分抑制剂的作用，还是两种或两种以上抑制剂的作用。

表1　各种类型抑制剂的Lineweaver-Burk作图比较Table1　The com parison of Lineweaver-Burk plots for each inhibitor

4　结论

可逆抑制剂的酶反应速度方程推导是基于单一抑制剂成分的作用，所划分的可逆抑制剂类型，如竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、反竞争性抑制剂和混合型抑制剂，只是对单一成分抑制剂而言。在研究动植物提取物、复方中药等对酶活性抑制作用时，由于酶抑制成分未知或较为复杂，不同浓度抑制剂Lineweaver-Burk图直线的交点有可能不共点。研究者容易忽视这一现象，往往简单地根据酶抑制剂作用的Lineweaver-Burk图直线的交点位置来判定抑制剂的作用类型，而实际可能是多种抑制成分共同作用的表观结果，这个表观结果与混合物中各抑制成分的浓度比例有关，尤其当提取物中含非竞争性抑制剂与竞争性抑制剂时，Lineweaver-Burk直线交点在第二象限，不在同一点，若试验中存在测定误差，则很容易被认为是单一混合型抑制剂类型，这也是在实际研究中，植物提取物较常被确定为酪氨酸酶混合型抑制剂的可能原因之一。多种抑制剂复合，具有不同于单一抑制剂的作用特点，抑制剂之间往往具有相互协同作用的效应[15]，其作用机制值得深入研究。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.010

收稿日期：2015-03-28

作者简介：王庆华（1969—），男（瑶），教授，硕士，从事生物活性物质研究与开发。

Effects of Compound Inhibitorson Reaction Kinetics of Tyrosinase

WANGQing-hua1，HEYun2，WANGXiao-yi2
（1.SchoolofBasic Courses，Guangdong PharmaceuticalUniversity，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Schoolof TraditionalChinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，510006，Guangdong，China）

Abstract：The inhibitory effects of combinations of cinnamic acid，azelaic acid and 4-hexylresorcinol on the activity of tyrosinase diphenolaseactivitywere studied bymeasuring theoxidation rateof L-dopa.The inhibition kinetics analyzed with Lineweaver-Burk plots demonstrated that azelaic acid and 4-hexylresorcinol were competitive inhibitors，cinnamic acid wasnoncompetitive inhibitor.Lineweaver-Burk plotsof the combinations of two competitive inhibitors（cinnamic Acid and azelaic acid）showed a familyof lineswith a common intercept on the 1/v axis，but the straight lines of the combinations of one competitive inhiitor and one noncompetitive inhibitor（Cinnamic acid and azelaic Acid，Cinnamic acid and 4-hexylresorcinol）showed different intersection points in the second quadrant.The kinetic equation of composite inhibitorwas derived with the King-Altman plotand the characteristic of Lineweaver-Burk plotsof composite inhibitorwasalso analyzed，the experimental resultswere consistentwith theoreticalanalysis.

Keywords：tyrosinase；kinetics；composite inhibitor；azelaic acid；4-hexylresorcinol；cinnamic acid