旋覆归连方醇提液镇痛抗感染作用的实验研究

高小玲，崔姗姗，汪保英，王慧慧，陈玉龙

旋覆归连方是本课题组结合大量食管癌相关文献和应用抗肿瘤体外模型进行药物筛选，立足于理气祛痰、活血化瘀、清热解毒的治疗原则，将多法合于一方总结出来的［1-3］。方中旋覆花具有降气止呕、消痰散结、通利血脉之功效，在本方中作为君药;当归具有补血活血、调经止痛、润肠通便、下气止咳之作用［4-5］;黄连具有泻火解毒、清热燥湿之功能［6］。三药配合，共凑降气化痰活瘀、清热解毒散结、抑瘤生长之功能。本课题组前期的实验结果表明，该方能够明显抑制食管癌细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的生长，并能够阻滞肿瘤细胞周期，可将食管癌ECa9706细胞周期阻滞在G0/G1期［7］。疼痛、炎性增生等是肿瘤患者的常见症状。为了探讨旋覆归连方的药理作用，为临床应用提供理论依据，本实验观察旋覆归连方醇提液镇痛及抗感染作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 昆明小鼠240只，SPF级，6～8周龄，雌150只、雄90只，体质量18～22 g，购自山东鲁抗医药集团有限公司，许可证号:SCXK(鲁)20130001，在河南中医学院SPF级动物实验中心饲养。

1.2 试验药物 旋覆花、当归、黄连购自河南中医学院第三附属医院，由本实验室提取有效部位并按旋覆花∶当归∶黄连=9∶6∶5比例，加入10倍85%乙醇，1周后取药液，过滤，旋转蒸发仪回收乙醇，所得浸膏充分蒸发水分后称重。实验时以0.5%羧甲基纤维素钠配成所需浓度。阿司匹林:西安利君制药有限责任公司生产，国药准字H61021710;醋酸地塞米松片:浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号140301。

1.3 热板致痛作用 雌性小鼠置于 (55.0±0.5)℃智能热板仪中，自投入热板至出现舔后足时间为其痛阈，取痛阈为5～30 s的小鼠60只，采用随机数字表法分为5组，空白对照组(羧甲基纤维素钠)、阿司匹林组 (阿司匹林溶液 0.2 g·kg-1·d-1，0.01 g/ml)、旋覆归连方低剂量组 (旋覆归连方醇提液0.45 g/kg)、旋覆归连方中剂量组 (旋覆归连方醇提液0.90 g/kg)、旋覆归连方高剂量组 (旋覆归连方醇提液1.80 g/kg)，每组12只。测定正常痛阈后，各组以不同药物0.2 ml/10 g分别连续灌胃4 d。于给药前和末次给药后30 min、1 h、2 h分别测小鼠痛阈1次［8］。

1.4 冰乙酸致痛作用 剩余小鼠随机选取60只，雌雄各半，采用随机数字表法分为5组，空白对照组 (羧甲基纤维素钠)、阿司匹林组 (阿司匹林溶液 0.2 g·kg-1·d-1，0.01 g/ml)、旋覆归连方低剂量组 (旋覆归连方醇提液0.45 g/kg)、旋覆归连方中剂量组 (旋覆归连方醇提液0.90 g/kg)、旋覆归连方高剂量组 (旋覆归连方醇提液1.80 g/kg)，每组12只。各组以不同药物0.2 ml/10 g分别连续灌胃4 d，末次给药后1 h腹腔注射0.6%冰乙酸氯化钠溶液0.2 ml，记录20 min 内小鼠扭体次数［5］。

1.5 耳郭二甲苯致炎作用 剩余小鼠随机选取60只，雌雄各半，采用随机数字表法分为5组，空白对照组 (羧甲基纤维素钠)、地塞米松组 (地塞米松0.02 g·kg-1·d-1)、旋覆归连方低剂量组 (旋覆归连方醇提液0.45 g/kg)、旋覆归连方中剂量组 (旋覆归连方醇提液0.90 g/kg)、旋覆归连方高剂量组 (旋覆归连方醇提液1.80 g/kg)，每组12只。各组以不同药物0.2 ml/10 g分别连续灌胃4 d，最后1次于实验前1 h灌胃。实验时将60 μl二甲苯均匀涂于小鼠右耳两面致炎，左耳做对照，20 min后处死小鼠，用直径7 mm的打孔器将小鼠双耳同部位等面积切下，用电子天平称重，以左右耳质量之差为耳郭肿胀度［9］。

1.6 肉芽肿组织净质量 剩余小鼠60只，雌雄各半。采用10%水合氯醛0.38 g/kg腹腔注射麻醉，左右腋窝各放入质量为10 mg的经高压灭菌棉球，缝合切口。术后第2天，采用随机数字表法分为5组，空白对照组 (羧甲基纤维素钠)、地塞米松组 (地塞米松0.02 g·kg-1·d-1)、旋覆归连方低剂量组(旋覆归连方醇提液0.45 g/kg)、旋覆归连方中剂量组 (旋覆归连方醇提液0.90 g/kg)、旋覆归连方高剂量组 (旋覆归连方醇提液1.80 g/kg)，每组12只。各组连续灌胃8 d后处死小鼠，取出两侧的棉球及肉芽肿组织，于80℃烘箱烘2 h，取出棉球后称重，除以2即为一侧平均肉芽肿组织质量，此质量与植入时棉球质量之差即为肉芽肿组织净质量［9］。

1.7 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行数据处理，计量资料以 (±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，不同时间痛阈比较采用两因素重复测量方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠不同时间痛阈比较 痛阈治疗方法与时间无交互作用 (P＞0.05);组间痛阈比较，差异无统计学意义 (P＞0.05);不同时间痛阈比较，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。

2.2 各组小鼠扭体次数比较 5组小鼠扭体次数比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。与空白对照组比较，阿司匹林组、旋覆归连方低剂量组、旋覆归连方中剂量组、旋覆归连方高剂量组小鼠扭体次数减少，差异有统计学意义 (P＜0.05);与阿司匹林组比较，旋覆归连方低剂量组、旋覆归连方中剂量组、旋覆归连方高剂量组小鼠扭体次数增多，差异有统计学意义 (P＜0.05);与旋覆归连方中剂量组比较，旋覆归连方高剂量组小鼠扭体次数减少，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表2)。

表1 各组小鼠不同时间痛阈比较 (±s，s)Table 1 Comparison of pain threshold in different time among different groups of mice

表1 各组小鼠不同时间痛阈比较 (±s，s)Table 1 Comparison of pain threshold in different time among different groups of mice

注:○部分小鼠死亡

组别 只数○ 给药前 给药后30 min给药后1 h 给药后12 18.8 ±4.6 20.3 ±5.3 17.2 ±7.6 24.0 ±8.2阿司匹林组 10 18.2 ±5.2 21.5 ±6.4 27.1 ±5.3 35.2 ±8.9旋覆归连方低剂量组 11 17.3 ±6.8 24.4 ±5.0 23.5 ±6.7 28.6 ±8.7旋覆归连方中剂量组 12 16.8 ±4.2 18.4 ±4.4 28.5 ±7.0 22.6 ±7.5旋覆归连方高剂量组 11 16.4 ±4.2 18.4 ±6.1 19.0 ±5.4 26.2 ±9.0 F 2 h空白对照组值=0.001 F交互 =1.212，F组间 =1.062，F时间 =4.759 P 值 P交互 =0.283，P组间 =0.388，P时间

表2 各组小鼠扭体次数比较 (±s，次)Table 2 Comparison of writhing times among different groups of mice

表2 各组小鼠扭体次数比较 (±s，次)Table 2 Comparison of writhing times among different groups of mice

注:与空白对照组比较，*P＜0.05;与阿司匹林组比较，△P＜0.05;与旋覆归连方中剂量组比较，▲P＜0.05;○部分小鼠死亡

组别 只数○ 扭体次数12 30.8 ±7.3阿司匹林组 11 2.2 ±1.0*旋覆归连方低剂量组 11 13.3 ±6.0＊△旋覆归连方中剂量组 12 17.3 ±4.0＊△旋覆归连方高剂量组 12 9.1 ±3.4＊△▲F空白对照组＜0.001 55.850 P值值

2.3 各组小鼠耳郭肿胀度比较 5组小鼠耳郭肿胀度比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。地塞米松组耳郭肿胀度较空白对照组减轻，差异有统计学意义 (P＜0.05);空白对照组、旋覆归连方低剂量组、旋覆归连方中剂量组、旋覆归连方高剂量组小鼠耳郭肿胀度比较，差异无统计学意义 (P＞0.05，见表3)。

表3 各组小鼠耳郭肿胀度比较 (±s，mg)Table 3 Comparison of auricle swelling degree among different groups of mice

表3 各组小鼠耳郭肿胀度比较 (±s，mg)Table 3 Comparison of auricle swelling degree among different groups of mice

注:与空白对照组比较，*P＜0.05

12 17.2 ±6.2地塞米松组 12 9.1 ±4.2*旋覆归连方低剂量组 12 11.6 ±5.7旋覆归连方中剂量组 12 14.9 ±6.5旋覆归连方高剂量组 12 14.2 ±6.4 F组别 只数 肿胀度空白对照组2.710 P值值0.039

2.4 各组小鼠肉芽肿组织净质量比较 5组小鼠肉芽肿组织净质量比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。与空白对照组比较，地塞米松组、旋覆归连方低剂量组、旋覆归连方中剂量组、旋覆归连方高剂量组小鼠肉芽肿组织净质量减少，差异有统计学意义 (P＜0.05);地塞米松组、旋覆归连方低剂量组、旋覆归连方中剂量组、旋覆归连方高剂量组小鼠肉芽肿组织净质量比较，差异无统计学意义 (P＞0.05，见表4)。

表4 各组小鼠肉芽肿组织净质量比较 (±s，mg)Table 4 Comparison of net weight of granuloma among different groups of mice

表4 各组小鼠肉芽肿组织净质量比较 (±s，mg)Table 4 Comparison of net weight of granuloma among different groups of mice

注:与空白对照组比较，*P＜0.05;○部分小鼠死亡

组别 只数○10 30.1 ±11.2地塞米松组 10 17.4 ± 6.5*旋覆归连方低剂量组 10 19.4± 7.8*旋覆归连方中剂量组 9 18.0± 7.0*旋覆归连方高剂量组 10 18.4± 6.6*F肉芽肿净质量空白对照组4.370 P值值0.005

3 讨论

炎症为常见病理变化，疼痛是炎症的常见症状，也是肿瘤发生发展过程中的重要因素。旋覆花的活性内酯具有抗感染、抗肿瘤等药理作用［10］，当归有效成分挥发油、有机酸、碳水化合物、氨基酸以及黄连主要成分黄连素等，在炎症、肿瘤以及疼痛研究中疗效肯定［11-12］。旋覆归连方是本课题组经过对肿瘤细胞的筛选及基于中药理论所组的方剂，并已取得国家发明专利 (专利号:ZL201210131821.X)。细胞实验研究表明，旋覆归连方85%醇提液所得提取物对食管癌细胞的抑制作用比较稳定［13］。本实验从镇痛、抗感染方面考察旋覆归连方醇提液的作用，为该方体外应用提供了基础。

本研究结果表明，不同时间间痛阈比较有差异。由于热板反复检测小鼠痛阈，小鼠短时间内容易产生适应性，因此组内结果差异不大，而阿司匹林组在此实验中，结果也不明显，可能因为阿司匹林更适于慢性钝痛。旋覆归连方醇提液可减少冰乙酸所致小鼠扭体次数，表明旋覆归连方对冰乙酸所致慢性钝痛有一定的作用。旋覆归连方醇提液可降低小鼠皮下包埋棉球引起的慢性肉芽肿反应，与食管癌临床治疗的适应证相符，表明该方具有良好的抗感染作用。值得注意的是其对慢性肉芽肿治疗作用明显，旋覆归连方低剂量组与地塞米松组无差异。

慢性肉芽肿主要病理成分为上皮细胞和巨噬细胞，血管生成明显，且白介素 (IL)-8高表达并发挥重要病理作用。IL-8是影响反流性胃食管疾病中食管上皮迁移、纤维化和癌变的重要炎性递质［14］。本课题组前期研究发现，旋覆归连方对细胞周期信号通路相关基因、蛋白激酶 (AKT1)、核因子(NF)-κB、丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK)-9及多个炎症相关基因表达具有很好的抑制作用，其中用药组IL-8表达明显下降［13］。IL-8及其受体在食管鳞癌患者血清及组织中呈高表达，并与肿瘤分期、预后，特别是淋巴和远端转移密切相关，可以作为预测肿瘤结果和选择相应治疗方法的潜在标志物［15-16］。

综上所述，肿瘤与慢性炎症关系密切，本实验旋覆归连方醇提液镇痛和抗感染疗效显著，该方是否通过IL-8信号调控肿瘤细胞与其微环境而起到止痛抗感染及抗肿瘤作用，将在下一步进行研究。

［1］ Zhou L，Hong SL，Chen YL.Effects of Chinese herbs on tumor angiogenesis［J］.China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2013，11(28):1619-1622.(in Chinese)

周凌，洪素兰，陈玉龙.中医药对肿瘤血管生成的影响［J］.中医学报，2013，11(28):1619-1622.

［2］ Chen YL，Miao YY，Si FC.Comparative study on inhibitory effect of reinforcing spleen and stomach recipes on tumour growth ［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2010，16(3):112-115.(in Chinese)

陈玉龙，苗艳艳，司富春.健脾和胃类方对肿瘤细胞生长抑制的比较研究 ［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(3):112-115.

［3］陈玉龙，司富春.中医药治疗食道癌方药分析［J］.时珍国医国药，2008，19(2):401-402.

［4］李娅玲，翟新贵，王喜梅.复方当归注射液治疗类风湿性关节炎的疗效观察 ［J］.中国煤炭工业医学杂志，2012，15(7):1026-1027.

［5］曾令渠，唐霞.当归四逆汤临证心得 (附三例报告)［J］.实用心脑肺血管病杂志，2010，18(5):625.

［6］孙永琦.双黄连粉针剂治疗病毒性心肌炎的疗效观察［J］.实用心脑肺血管病杂志，2011，19(8):1381.

［7］ Ma JH，Chen YL，Wang HB，et al.The relationship between inhibitory effect of Xuanfuguilian prescription on the growth of esophageal cells ECA9706 and its components［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2013，36(2):265-271.(in Chinese)

马俊华，陈玉龙，王海波，等.旋覆归连方抑制食管癌细胞ECA9706生长作用与组分关系分析 ［J］.中药材，2013，36(2):265-271.

［8］ Li D，Wu YS，Wang C，et al.Pharmacokinetics research on antiinflammatory effect and analgesic effect of indigo naturalis［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2011，17(13):137-140.(in Chinese)

李东，武彦舒，王灿，等.青黛镇痛、抗炎药效学研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(13):137-140.

［9］ WangM，ChenJR，SongCR，et al.Analgesicandantiinflammatory effect of prepared rhei radix et rhizoma with wine ［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2013，19(5):255-257.(in Chinese)

王梅，陈俊荣，宋翠荣，等.酒大黄的镇痛抗炎作用［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(5):255-257.

［10］ Zhu H，Tang SA，Qin N，et al.Anti-inflammatory constituents from inula japonica ［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2014，39(1):83-88.(in Chinese)

朱虹，唐生安，秦楠，等.旋覆花中化学成分及其活性研究［J］.中国中药杂志，2014，39(1):83-88.

［11］ Li M，Li HF，Cui WL，et al.Progress research of angelica main chemicalcomposition and the antiviral，anti- inflammatory pharmacological［J］.Shandong Journal of Traditional Chinese Medicine，2013，32(9):694-695.(in Chinese)

李明，李慧芬，崔伟亮，等.当归主要化学成分及抗病毒、抗炎药理作用研究进展 ［J］.山东中医杂志，2013，32(9):694-695.

［12］ Feng YB，Luo WQ，Zhu SQ.Explore new clinical application of Huanglian and corresponding compound prescription from their traditional use ［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2008，33(10):1221-1225.(in Chinese)

冯奕斌，罗伟权，朱世清.从黄连及其复方古今临床应用，发掘现代临床新应用 ［J］.中国中药杂志，2008，33(10):1221-1225.

［13］马俊华.基于痰瘀毒病机所组旋覆归连方抑制食管癌细胞生长机制的研究［D］.郑州:河南中医学院，2013.

［14］ Kim JH，Frantz AM，Anderson KL，et al.Interleukin-8 promotes canine hemangiosarcoma growth by regulating the tumor microenvironment［J］.Exp Cell Res，2014，323(1):155-164.

［15］ Rieder F，Biancani P，Harnett K，et al.Inflammatory mediators in gastroesophageal refluxdisease:impacton esophagealmotility，fibrosis，and carcinogenesis［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physio，2010，298(5):G571-581.

［16］ Ogura M，Takeuchi H，Kawakubo H，et al.Clinical significance of CXCL-8/CXCR-2 network in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Surgery，2013，154(3):512-520.