阿托伐他汀对急性冠脉综合征患者外周血单核细胞源性巨噬细胞脂蛋白相关磷脂酶A2的影响

郭 敏,闫 蕊,史宏涛,王彩霞,郭 爽,肖传实

阿托伐他汀对急性冠脉综合征患者外周血单核细胞源性巨噬细胞脂蛋白相关磷脂酶A2的影响

郭 敏1,闫 蕊2,史宏涛1,王彩霞1,郭 爽1,肖传实1

目的观察阿托伐他汀对急性冠脉综合征(ACS)患者外周血单核细胞源性巨噬细胞脂蛋白相关磷脂酶A2[Lp-PLA (2)]的影响。方法入选2013年3月—2013年12月ACS患者38例,分离培养ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞,分为4组:空白对照组、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)组、阿托伐他汀低浓度组和阿托伐他汀高浓度组。分别给予不同处理,收集培养细胞上清液及巨噬细胞,实时定量RT-PCR法检测巨噬细胞Lp-PLA(2)m RNA表达,Western-blot法检测巨噬细胞Lp-PLA(2)蛋白表达,ELISA法检测培养细胞上清液Lp-PLA(2)、超敏C反应蛋白(hsCRP)、单核细胞趋化因子(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)水平。结果ox-LDL刺激可以明显增加ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞Lp-PLA(2)m RNA与蛋白的表达,而阿托伐他汀可以显著降低其诱导的Lp-PLA(2)表达增加及炎症因子分泌,且该反应呈浓度依赖性。结论阿托伐他汀抑制ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞Lp-PLA(2)的表达,从而起到调节炎症反应,稳定斑块作用。

急性冠脉综合征;脂蛋白相关磷脂酶A2;阿托伐他汀;单核细胞源性巨噬细胞

冠心病(CAD)不仅是一种冠状动脉壁内脂质堆积性疾病,而且慢性炎症及免疫反应也参与了动脉粥样硬化的发生发展[1]。炎症反应在ACS不稳定斑块的发生、发展及最终破裂过程中起着至关重要的作用[2]。脂蛋白相关磷脂酶A2[Lp-PLA(2)]是一种与CAD密切相关的新的炎症标志物[3]。阿托伐他汀除了调脂作用,还具有血管保护及抗炎作用。本研究体外培养急性冠脉综合征(ACS)患者的外周血单核细胞源性巨噬细胞,观察不同剂量阿托伐他汀对巨噬细胞Lp-PLA(2)表达的影响,阐述其稳定斑块及调节慢性炎症反应的可能机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 为2013年3月—2013年12月山西医科大学第一医院心内科住院ACS患者38例,急性心肌梗死(AM I)18例,不稳定型心绞痛(UA)20例。所有患者进行冠脉造影或心电图、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白等心肌标志物检查确诊。剔除:合并脑卒中、严重肝肾功能不全者;周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病;恶性肿瘤和风湿性疾病;合并感染性疾病以及应用炎症抑制药物如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物等。

1.2 外周血单核源性巨噬细胞分离培养 按照Taylo r等[3]方法培养,流式细胞术检测CD14对其进行鉴定。将磁珠分选细胞调整细胞数至2×106/ml,用含20%新生牛血清的RPM I-1640培养液重悬接种于六孔板,加入10 ng/ml 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的1640培养液,培养7 d后即获得单核细胞源性巨噬细胞。

1.3 分组 将分离培养的单核细胞源性巨噬细胞分为4组。①ACS:不加任何药物孵育24 h;②氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)组:加入ox-LDL(50 mg/L)刺激24 h;③低浓度组:同时加入ox-LDL(50 mg/L,广州中山医科大学)及10μm o l/L阿托伐他汀(辉瑞公司)共刺激24 h;④高浓度组:同时加入ox-LDL(50 mg/L)及40μm o l/L阿托伐他汀共刺激24 h。所有细胞培养均于37℃,5%CO2条件下进行,之后收集上清液冻存于-80℃备用,收集巨噬细胞用于下一步研究。

1.4 实时定量RT-PCR检测Lp-PLA(2)m RNA的相对表达 取收集的巨噬细胞,采用Trizo l一步法抽提总RNA,利用TAKARA逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,逆转录条件为50℃30 min,95℃15℃min灭火逆转录酶;使用ABI7900实时定量PCR仪采用TAKARA SYBR-G reen试剂盒进行PCR反应。引物均由上海生物工程公司合成,计算机分析得到Ct值。基因相对表达量以2-△△Ct值计算分析。

1.5 Western-b lot法检测Lp-PLA(2) 蛋白的相对表达BCA法测蛋白浓度,Western-b lo t法检测Lp-PLA(2)蛋白的相对表达。

1.6 ELISA法检测细胞上清液Lp-PLA(2)及炎症因子的表达 试剂盒购自Bender MedSystem s公司。采用双抗夹心法,标准曲线求得样品中Lp-PLA(2)、超敏C反应蛋白(hsCRP)、单核细胞趋化因子(MCP-1)、肿瘤坏死因子-6(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的浓度。

1.7 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件,计量资料以均数±标准差(±s)表示,各组数据进行正态性和方差齐性检验,组间均数比较采用ANOVA方差分析,两两比较用SNK法检验。P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组巨噬细胞分泌Lp-PLA(2)及炎症因子水平ox-LDL可以诱导冠心病患者外周血单核细分泌Lp-PLA(2)及炎症因子hsCRP、MCP-1、TNF-α、IL-6的水平(P<0.05),而阿托伐他汀可以显著降低其诱导的Lp-PLA(2)及炎症因子分泌(P<0.05),且此种效应呈浓度依赖性。详见表1。

表1 各组巨噬细胞分泌Lp-PLA(2)及炎症因子的水平(±s)

组别Lp PLA(2)(pg/ml)MCP 1(pg/ml)TNFα(ng/ml)IL 6(pg/ml) ACS组100.71±15.8 87.64±7.12 12.76±1.12 500.47±46.92 ox LDL组370.49±43.051)350.11±31.781)28.9±3.241)1 230.64±120.151)低浓度组256.03±29.332)216.72±18.942)20.17±2.052)880.73±10.472)高浓度组188.74±20.192)160.28±18.732)15.83±1.182)613.88±66.322)与ACS组相比,1)P<0.05,与ox LDL组相比,2)P<0.05。

2.2 各组巨噬细胞内Lp-PLA(2)m RNA的表达ox-LDL可以诱导ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞内Lp-PLA(2)m RNA的表达(P<0.01),阿托伐他汀可以显著降低其诱导的Lp-PLA(2)m RNA表达(P<0.05或P<0.01),且此种效应呈浓度依赖性。详见图1。

图1 各组巨噬细胞LP-PLA(A2)m RNA的相对表达

2.3 各组巨噬细胞内Lp-PLA(2)蛋白的表达ox-LDL可以诱导冠心病患者外周血巨噬细胞Lp-PLA(2)蛋白的表达(P<0.01),阿托伐他汀可以显著降低其诱导的Lp-PLA(2)蛋白表达(P<0.05或P<0.01),且此种效应呈浓度依赖性。详见图2。

3 讨 论

慢性炎症能增加冠状动脉疾病风险。各种炎症细胞及炎症因子的局部浸润、循环中炎症细胞的活化,血小板的活化及黏附均可导致斑块破裂及ACS发生[4]。Lp-PLA(2)是近年来新发现的与动脉粥样硬化密切相关的新型炎症因子,它不仅具有促进动脉粥样硬化的作用,同时与斑块的易损性密切相关,可作为独立预测冠心病事件的新的危险因子[5]。

图2 各组巨噬细胞LP-PLA(A2)蛋白的相对表达

Lp-PLA(2)属于磷脂酶A2超家族成员,主要由炎症细胞分泌,与磷脂酶A2家族其余成员不同的是,Lp-PLA(2)不依赖钙离子维持其催化活性。人循环中的Lp-PLA(2)可以以与脂蛋白颗粒结合的形式存在,其中2/3与LDL结合,1/3与HDL/VLDL结合。Lp-PLA(2)可以通过水解Sn-2位含有多不饱和脂肪酰基的氧化磷脂,使循环中LDL相关Lp-PLA(2)复合物进入内膜,在内膜LDL被氧化,LDL上的卵磷脂变成氧化卵磷脂,而Lp-PLA(2)随即水解氧化卵磷脂生成溶血卵磷脂和氧化型游离脂肪酸,后两者均为促炎介质,能刺激黏附因子和细胞因子的产生,促进单核细胞向巨噬细胞的转化及泡沫细胞的形成,Lp-PLA(2)具有促动脉粥样硬化形成的作用。Lp-PLA(2)还有降解血小板活化因子的作用,减轻其促进血栓形成和炎症反应的作用而发挥抗炎和抗动脉粥样硬化的作用。但临床及实验室研究均证实, Lp-PLA(2)在血浆中占优势的作用是很强的促动脉粥样硬化形成作用[4]。最新流行病学和临床前瞻性研究发现,冠心病事件人群与正常对照组相比Lp-PLA (2)表达及活性显著升高,从而提出Lp-PLA(2)质量或活性升高是冠状动脉粥样硬化或冠心病事件的独立危险因子[68]。因此,抑制Lp-PLA(2)的活性为治疗血管慢性炎症,减少心血管事件的风险提供了可能。

他汀类药物是3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂,作为治疗冠心病的常规用药,大量的临床试验证实他汀类具有独立于降脂作用之外的多效性作用,包括抗炎、稳定斑块、改善血管内皮、抑制血管平滑肌的增殖、抑制血栓等作用,近年来其非调脂作用已越来越受到人们的重视[9]。辛伐他汀可以明显减少兔动脉粥样硬化模型中大动脉内Lp-PLA(2)的表达及其活性[10]。本研究结果显示, ox-LDL刺激可以明显增加Lp-PLA(2)转录水平及蛋白水平的表达,而给予阿托伐他汀共刺激后可以明显抑制ox-LDL诱导的Lp-PLA(2)及炎症因子的表达,此效应呈浓度依赖性。

在人的单核细胞源性巨噬细胞中证实,阿托伐他汀可以通过抑制ox-LDL诱导的新型炎症因子Lp-PLA(2)表达而起到调节免疫反应及稳定斑块的作用。

ox-LDL可以通过诱导单核细胞产生Lp-PLA(2)而参与了冠心病的发生发展过程。而阿托伐他汀可以抑制该效应而起到稳定斑块的作用,为深入理解其作用机制及临床科学的应用提供了理论基础。

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R541 R256

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.05.007

1672-1349(2015)05-0578-03

2015-03-30)

(本文编辑 王雅洁)

山西省青年科技研究基金项目(No.2013021035-2)

1山西医科大学第一医院(太原030001),E-mail:4337540@ qq.com;2山西医科大学护理学院

肖传实,E-mail:43375407@qq.com