不同花粉多酚类物质组成比较

李红兵，米　佳，张林锁，罗　青，李晓莺，曹有龙，李越鲲，戴国礼，冉林武，闫亚美，*（.宁夏医科大学实验动物中心，宁夏银川75000；.国家枸杞花粉工程技术研究中心，宁夏银川75000；.北方民族大学生命学院，宁夏银川750004）

不同花粉多酚类物质组成比较

李红兵1，米佳2，张林锁3，罗青2，李晓莺2，曹有龙2，李越鲲2，戴国礼2，冉林武1，闫亚美2，*
（1.宁夏医科大学实验动物中心，宁夏银川750002；2.国家枸杞花粉工程技术研究中心，宁夏银川750002；3.北方民族大学生命学院，宁夏银川750004）

摘要：采用分光光度计法、HPLC、HPLC-MS法分析测定、鉴定枸杞花粉等多酚类物质含量及主要组成。结果表明，枸杞花粉等6种不同多酚类物质来源的植物材料总多酚类物质含量的变化幅度为0.82 g/100 g～3.92 g/100 g。其中油菜花粉总多酚类物质含量最高，其次是枸杞花粉。各种花粉中的主要多酚类物质是黄酮类。枸杞花粉黄酮类物质含量分别是荷花花粉、油菜花粉、荞麦花粉、向日葵花粉和茶花粉的1.42、0.72、2.78、1.20、2.37倍。初步分离鉴定出枸杞花粉多酚类物质10个，其中主要组分有3个，含量均大于其它所测市售花粉。结果表明，较其它5种蜂花粉材料，枸杞花粉中多酚类物质主要组分与之差异较大，是较好的开发功能性食品的资源。

关键词：枸杞花粉；不同市售花粉；多酚类物质

蜂花粉作为植物遗传基因源，富含多酚类物质特别是黄酮类化合物、多糖等多种功效成分[1-3]，具有抗氧化、抑菌、美容、治疗前列腺增生等作用[1-4]。

氧化应激是许多慢性退行性疾病发生发展的主要机制。探寻和研究具有抗氧化活性的天然植物化学物用于防治衰老相关的多种疾病，如阿尔茨海默病、动脉粥样硬化等，成为医药、植物化学等多个学术领域共同关注的课题。

多酚类物质是隶属于黄酮类化合物的一类多酚类物质。大量体内外研究表明，多酚类物质通过其较强的抗氧化清除自由基作用[5-9]，显示出抗炎、保护心血管、抗肿瘤等多种生物活性。因此许多富含多酚类物质的物质如蓝莓、葡萄皮等在国外已经得到了开发利用。

传统药食两用滋补品枸杞，是目前我国西北地区特别是宁夏、青海、内蒙等地广泛种植的经济林木之一。《本草纲目》载：枸杞，春采叶，名“天精草”；夏采花，名“长生草”；秋采果，名“枸杞子”；冬采根，名“地骨皮”，即其根、茎、叶、花、果均为宝贵药材，但枸杞蜂花粉的研究少见报道。本文开展了枸杞蜂花粉与其它5种市售蜂花粉多酚类物质的含量及组成研究，旨在为枸杞新资源开发的研究奠定基础，为拓宽枸杞大产业加工领域，使其向功能性食品和药品的精深领域发展提供科学理论参考。

1　材料和方法

1.1材料与试剂

枸杞花粉采摘于国家枸杞花粉工程技术研究中心资源圃。其它新鲜市售花粉购于市场。采集或采购的花粉于-23℃保存。

DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、ABTS [2，2’-azinobis（3-ethylbenzenothiazoline-6-sulfonic）]、TPTZ（1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine）、VC、Folin-Ciocalteu试剂：购自美国Sigma公司；色谱纯甲醇、三氟乙酸：购自MREDA公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2仪器与设备

1260高效液相色谱仪、AgilentZORBAX Stable Bond SB-C18 880975-902色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：安捷伦，美国；TSQ三重四极杆液相色谱-质谱联用仪：THERMO；RE-5286旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；UV755B紫外可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；KQ-250E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1样品的制备

取3.00 g枸杞花粉等6种花粉研磨粉末，加50 mL 1%甲酸甲醇溶液，匀浆，超声提取30 min，重复3次，合并滤液滤纸抽滤，取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，定容至200 mL，-20℃保存备用。

1.2.2总酚含量的测定

总酚含量的测定参考Liu等[10]的方法并稍作修改。将0.5 mL提取液加入到盛有1 mL蒸馏水的试管中，再加入0.3 mL稀释10倍的Folin-Ciocalteu试剂，混匀，加入3mL1mol/LNa2CO3溶液，充分混匀后，在25℃黑暗处反应80、760 nm处测定吸光度值。样品中总酚含量以每100克花粉中没食子酸当量（g GAE/100 g）表示。

1.2.3黄酮含量的测定

黄酮含量的测定参考Liu等[11]的方法并稍作修改。取0.5 mL提取液置于盛有4 mL 30%乙醇的试管中，加入0.5 mL 5%NaNO2溶液，摇匀，静置6 min，加入0.5 mL 10%Al（NO3）3溶液，摇匀，静置6 min，加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，静置5 min后，定容至15 mL，在510 nm下测定吸光度值。样品中黄酮含量以每100g花粉中芦丁当量（g RE/100 g）表示。

1.2.4枸杞花粉活性成分分离、鉴定

1.2.4.1色谱条件的选择

流动相A：2%乙酸水溶液，B：甲醇；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30℃。梯度洗脱条件如表1所示。

表1　HPLC梯度洗脱条件Table 1　The requirement of HPLC gradient elution

1.2.4.2枸杞花粉多酚类物质HPLC-MS分离鉴定

1）枸杞花粉多酚类物质HPLC分析条件同上。

2）枸杞花粉多酚类物质MS分析条件

枸杞花粉多酚类物质MS分析条件如表2所示。

表2　枸杞花粉多酚类物质MS分析条件Table 2　The analysis requirement of MS

1.3统计分析

采用Excel 2003、SPSS 16.0、中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件（国家药典委员会）进行数据处理及分析。

2　结果分析与讨论

2.1不同市售花粉多酚类物质组成及含量比较

不同市售花粉多酚类物质组成及含量比较如表3所示。

表3　不同市售花粉多酚类物质含量及特征组分Table 3　The compositions and contents of polyphenol in different bee pollen

由表3可知，所选的6种富含多酚类物质活性物质的市售花粉中，各种市售花粉多酚类物质含量差异较大，但主要的物质为黄酮类化合物。其中，油菜花粉多酚类物质含量最高，枸杞花粉次之，荞麦花粉含量最小。枸杞花粉多酚类物质含量分别是油菜花粉、荷花花粉、荞麦花粉、向日葵花粉和茶花粉的0.72、1.42、2.78、1.20和2.37倍。枸杞花粉资源是富含多酚类物质的资源。

2.2各种市售蜂花粉多酚类物质的HPLC指纹图谱

HPLC分析不同花粉多酚，主要依据色谱的保留时间和峰面积，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件（国家药典委员会），输入各样品色谱图，谱图间距设置为30，得到不同花粉多酚HPLC色谱叠加图（S1-S6），见图1。

图1　不同蜂花粉多酚类物质HPLC图Fig.1　HPLC profile of polyphenol（280 nm）of different bee pollen

设定枸杞花粉样品为参照图谱，时间窗设定为0.1，将各色谱峰进行匹配，如表4所示。

表4　不同花粉多酚HPLC指纹图谱匹配结果Table 4　The matching results of the polyphenols HPLC finger printing in different pollen

各种花粉多酚没有共有峰，且枸杞花粉主要多酚组分只有3个，保留时间分别为40.18、47.78 min、和69.98 min，除了油菜花粉含有极少量共有化合物外，其它花粉均未含有。因此，枸杞花粉多酚组成有别于其它所测花粉。且该化合物峰面积远远高于其它花粉主要组分峰面积，即可能含量远高于其它花粉。

2.3枸杞花粉多酚类物质主要组分分离鉴定

HPLC-MS法是目前多酚类物质分离鉴定的主要方法之一[12-14]，主要依据色谱的保留时间和质谱信息包括分子量信息等，参照文献信息进行化合物的鉴定。HPLCVAD-MS分离鉴定的枸杞花粉多酚类物质准分子离子、保留时间、及碎片离子信息如图1～图4及表5所示。

图2　枸杞花粉主要多酚化合物（峰5）MS+图Fig.2　MS+of the polyphenols main fractions from Lycum Barbarum pollen

图3　枸杞花粉主要多酚化合物（峰7）MS+图Fig.3　MS+of the polyphenols main fractions from Lycum Barbarum pollen

表5　枸杞花粉多酚类物质HPLC-MS鉴定的分子量及结构Table 5　Phenolic componds identified in the extract of Lycum pollen

图4　枸杞花粉主要多酚化合物（峰8）MS+图Fig.4　MS+of the polyphenols main fractions from Lycum Barbarum pollen

3　结论

较5种常见的天然市售花粉材料，枸杞花粉中富含多酚类物质，特别是黄酮类物质。枸杞花粉多酚类物质含量分别是荷花花粉、油菜花粉、荞麦花粉、向日葵花粉和茶花粉的0.72、1.42、2.78、1.20和2.37倍。除此外，枸杞花粉在成分组成上有别于其它花粉多酚类物质构成。该研究揭示，枸杞花粉可能作为较好的开发功能性食品的资源。对于其不同于其它花粉的多酚类物质组成成分、及其构效关系等，有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 俞秀玲.花粉的活性成分[J].食品工业科技,2007,4(28):235-237

[2]刘连亮.油菜花粉二氧化碳超临界萃取物对治疗前列腺增生的治疗作用[D].济南:山东师范大学,2008

[3]冉林武,闫亚美,曹有龙,等.响应面试验优化超声波法提取枸杞蜂花粉黄酮类化合物工艺[J].食品科学,2012,33(12):37-40

[4]闫亚美,冉林武,曹有龙,等.超声波法提取枸杞蜂花粉总酚物质的工艺研究[J].食品工业,2011,33(8):26-28.

[5]冉林武,闫亚美,曹有龙,等.三种蜂花粉19种金属元素测定分析[J].食品工业,2012,33(12):160-162

[6]李天娇,徐响,孙丽萍.植物ACE抑制肽与蜂花粉ACE抑制肽的研究现状[J].食品科学,2009,15(30):261-263

[7]Rao A V,Snyder D M.Raspberries and human health:A review[J].J Agric Food Chem,2010,58(7):3871-3883

[8]Kusznierewicz B,Piekarska A,Mrugalska B,et al.Phenolic composition and antioxidant properties of polish blue-berried honeysuckle genotypes by HPLC-DAD-MS,HPLC postcolumn derivatization with ABTS or FC,and TLC with DPPH visualization[J].J Agric Food Chem,2012,60(7):1755-1763

[9]Lakshmi S V,Padmaja G,Kuppusamy,et al.Oxidative stress in cardiovascular disease[J].Indian J Biochem Biophys,2010,46(6):421-440

[11]Liu L X,Sun Y,Laura T L,et al.Determination of polyphenolic content and antioxidant activity of kudingcha made from Ilex kudingcha C.J Tseng[J].Food Chem,2008,112(1):35-41

[12]Simirgiotis M J,Schmeda-Hirschmann G.Direct identification of phenolic constituents in Boldo Folium(Peumus boldus Mol.)infusions by high-performance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. JChromatogr A,2010,1217(4):443-449

[13]Mullen W,Marks S C,Crozier A.Evaluation of phenolic compounds in commercial fruit juices and fruit drinks[J].J Agric Food Chem, 2007,55(8):3148-3157

[14]George F,Figueiredo P,Toki K,et al.Influence of trans-cis isomerisation of coumaric acid substituents on colour variance and stabilisation in anthocynins[J].Phytochem,2001,57(5):791-795

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.030

收稿日期：2014-08-05

基金项目：宁夏回族自治区自然基金（NZ13101、NZ13128）；宁夏农林科学院院先导项目（NKYQ-13-01、NKYJ-15-16）

作者简介：李红兵（1968—），男（汉），实验师，大专，从事天然药物研究工作。

*通信作者：闫亚美（1982—），女（汉），副研究员，博士，从事枸杞深加工研究工作。

The Difference of the Compositions of Polyphenols from Different Bee Pollen

LI Hong-bing1，MI Jia2，ZHANG Lin-suo3，LUO Qing2，LI Xiao-ying2，CAO You-long2，LI Yue-kun2，DAI Guo-li2，RAN Lin-wu1，YAN Ya-mei2，*
（1.Laboratory Animal Center，Ningxia Medical University，Yinchuan 750002，Ningxia，China；2.National Wolfberry Engineering Research Center，Yinchuan 750002，Ningxia，China；3.College of Bionomy，Northern Nationality University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

Abstract：The polyphonols of of the 6 different kinds of bee pollen，including Lycum Barbarum Pollenwere evaluated in the study.The total contents of polyphenol were measured using spectrophotometer methods.HPLC and HPLC-MS methods were used to analyze the composition of the polyphenols.The results showed that the total polyphenols of 6 different kinds of bee pollen were 0.82 g/100 g-3.92 g/100 g.Comparatively，the total polyhenols content of Lycium ruthenicum pollen was 1.42 times，0.72 times，2.78 times，1.20 times，and 2.37 times higher than that of Hindu Lotus pollen，rape pollen，Fagopyrum esculentum Moench pollen，sunflower pollen and camellia pollen.10 polyphenols in Lycum Barbarum pollen were identified.Comparatively，Lycum Barbarum pollen had the higher value of total polyphenol content.It is a rich source of polyphenol，and one kinds of good resources for development of healthy food.

Key words：Lycum Barbarum pollen；different bee pollen；polyphenol