凝血酶敏感激素蛋白酶4／5在骨性关节炎滑膜中的表达及意义

王　京，张琪琪，胡　勇，魏　伟

Wang Jing，Zhang Qiqi，Hu Yong，et al（Dept of Orthopedicst，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei　230022）

凝血酶敏感激素蛋白酶4／5在骨性关节炎滑膜中的表达及意义

王京1，张琪琪1，胡勇1，魏伟2

摘要目的研究凝血酶敏感激素蛋白酶4／5（ADAMTS4／5）在骨性关节炎（OA）滑膜组织及滑膜细胞中的表达及意义。方法取6例正常者滑膜组织和6例OA患者滑膜组织，Western blot法检测标本中ADAMTS4／5的表达，离体培养正常者滑膜细胞。白介素-1β（IL-1β）刺激正常滑膜细胞，测定滑膜细胞中ADAMTS4／5的表达量；IL-1RA（IL-1β阻滞剂）抑制IL-1β后，测定滑膜细胞中ADAMTS4／5的表达量。结果ADAMTS4／5在OA患者滑膜组织中表达较正常者滑膜组织均显著增加；IL-1β刺激滑膜细胞后，ADAMTS4／5升高，IL-1RA可明显降低IL-1β诱导的滑膜细胞中ADAMTS4／5的表达。结论IL-1β可以按照剂量依赖方式正向调节ADAMTS4／5的表达；ADAMTS4／5和IL-1β在OA病变机制中发挥重要的作用。

关键词骨性关节炎；ADAMTS4／5；IL-1β；IL-1RA；滑膜细胞

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以骨质丢失、骨赘形成、关节畸形等为主要特征的退行性关节病，发病机制尚不明确。目前的观点凝血酶敏感激素蛋白酶4（aggrecanas4，ADAMTS4）主要是由炎性细胞因子诱导产生［1］。凝血酶敏感激素蛋白酶5 （aggrecanas5，ADAMTS5）主要是由病理性软骨细胞和滑膜成纤维表达［2］。ADAMTS4／5被认为能引起滑膜炎症性反应，最终导致OA的发生。白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）是在滑膜炎症反应中比较重要的一种细胞因子，其作用是能够刺激滑膜细胞增殖，产生相关降解酶，从而破坏关节软骨，最终引起关节炎症，与OA的发生发展有着密切的关系。目前ADAMTS4／5在滑膜组织和细胞中的表达仍存在争议。该研究采用Western blot法分别测定滑膜组织、细胞蛋白表达量，旨在探讨ADAMTS4／5、IL-1β和OA之间的关系。

1　材料与方法

1．1病例资料

收集2012年9月～2013年1月于安徽医科大学第一附属医院骨科就诊的OA患者的滑膜组织6例（OA组），另选因意外损伤导致股骨颈骨折患者的滑膜组织6例（对照组）。其中男4例，女8例；年龄35～85（57．50±7．35）岁。

1．2主要仪器

SDS-PAGE电泳仪和转膜仪（美国Bio-Tek公司）；－80℃超低温冰箱（日本三洋公司）；Bioshine ChemiQ 4600荧光及化学发光成像系统（中国Bioshine公司）；酶联免疫检测仪、组织匀浆器（上海欧翔科学仪器有限公司）；恒温箱（上海一恒科技有限公司）；显微镜（日本Olympus公司）；摇床、离心机（安徽医科大学临床药理研究所提供）。

1．3主要试剂

20%FBS培养液、IL-1β、白介素1受体拮抗剂（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA）、0．1%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM培养基、去离子水、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、PVDF膜、TEMED原溶液、Tris、脱脂奶粉、PBS缓冲液和吐温PBS缓冲液（上海南基生物科技有限公司）；兔抗ADAMTS4／5多克隆抗体（英国Abcam公司）；山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RIPA缓冲液和SDS-PAGE加样缓冲液（中国碧云天生物技术研究所）；ECL显影液（美国Thermo公司）。

1．4方法

1．4．1滑膜细胞的分离、培养以及传代

采用组织块法，标本在无菌条件下处理后（滴加2滴含20% FBS培养液），将组织块剪碎成约1 mm×1 mm× 1 mm大小，使用20%FBS处理后放置于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中约3 h。翻转培养瓶，使组织块浸没于培养液中，继续培养当检测细胞数值达到1×105个／ml时，传代至 24孔培养板中待用。

1．4．2组织蛋白鉴定

1．4．2．1组织的取材

经术前谈话已经获得患者本人和家属同意后，标本取自安徽医科大学第一附属医院关节外科中心髋、膝关节置换的患者，共取出12例，标本为新鲜滑膜组织，带无菌手套后使用手

2015－05－26接收

2安徽医科大学药理研究所，合肥230032

1．4．2．2组织蛋白提取

取对照组及 OA组各1 g，电子称精确测量后平均分为4组（加入约2．5 m l的蛋白裂解液），使用组织匀浆器小心充分研磨（冰浴条件下），直至完全研磨至无固态物质存留即加入1．5 ml EP管标序。分别取40μl蛋白样品至标序为1、2、3、4的EP管中，1、3号设为对照组，2、4号设为 OA组。加 Loading Buffer缓冲液煮沸10 min，冷却后，于－80℃冰箱保存。

1．4．2．3细胞蛋白提取

滑膜细胞传代至 60 mm培养皿中，待细胞充分融合，收集细胞，弃培养基，加入PBS 2 m l清洗培养皿1次，弃PBS。0．05%胰酶2 m l处理，37℃温育1 min。镜下观察细胞变形后，将细胞转移至一个1．5 ml EP管中，10 000 r／min离心3 min，4℃条件下弃EP管上清液，1 m l预冷的PBS清洗沉淀，10 000 r／min离心3 min，4℃条件下PBS清洗1次弃上清液，－80℃冻存待裂解，向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液，混匀后冰上放置40min，10 000 r／min离心15 min，4℃，将上清液（约250μl）转移至一个新的EP管中。

1．4．2．4Western blot法测定滑膜组织蛋白表达水平

10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，转移至PVDF膜上，37℃条件下5%脱脂牛奶封闭1．5 h，用ADAMTS4／5抗体（1∶200），β-actin（1∶1 000）孵育，4℃过夜，加入山羊抗兔标记二抗（1∶10 000），37℃温育1 h，ECL底物化学发光显影，检测各样本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分别与对应的β-actin蛋白灰度值比较，计算两者比值。

1．4．2．5Western blot法检测滑膜细胞蛋白表达水平

采集的蛋白样品（－20℃）冻存后，10%SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白质，转移至PVDF膜上，37℃条件下5%脱脂牛奶封闭2 h，用ADAMTS4／5抗体（1∶100），β-actin（1∶500）孵育，4℃过夜，加入山羊抗兔标记二抗（1∶5 000），37℃温育0．5 h，ECL底物化学发光显影，检测各样本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分别与对应的β-actin蛋白灰度值比较，计算两者比值。

1．4．3IL-1β与IL-1RA对滑膜细胞蛋白表达的测定

1．4．3．1IL-1β诱导对照组滑膜细胞

对照组滑膜细胞贴壁生长后，更换DMEM培养基（含0．1%BSA）继续培养24 h，更换DMEM培养基（含1、10 ng／m l IL-1β），各浓度分别做8个复孔，分别为试验组2、3；对照组为试验组1。作用时间为6 h，检测各样本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分别与对应的βactin蛋白灰度值比较，计算两者比值。

1．4．3．2IL-1RA降低IL-1β诱导水平

试验组1、试验组4（IL-1RA 500 ng／ml＋IL-1β10 ng／m l）、试验组5（IL-1RA 500 ng／ml＋IL-1β10 ng／ml）。IL-1RA预处理作用时间为2 h，后用IL-1β继续作用24 h，检测各样本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分别与对应的β-actin蛋白灰度值比较，计算两者比值。

1．5统计学处理

2　结果

2.1滑膜组织中ADAM TS4／5的表达情况

OA组ADAMTS4／5的表达明显高于对照组（F＝422．911、905．154，P＜0．01）。提示ADAMTS4／5在OA滑膜中高表达。见图1。

2．2滑膜细胞蛋白表达水平

IL-1β作用滑膜细胞后，随着剂量的增加，ADAMTS4的表达量增加但不明显，ADAMTS5的表达量明显增加（F＝60．100，P＜0．01），提示ADAMTS5的表达随着IL-1β刺激量增加呈逐渐升高的趋势（P＜0．01）。见图2。

2．3正常滑膜细胞的形态

倒置显微镜下观察，细胞核呈卵圆形，位于细胞中间，边界清楚，核仁清晰可见；IL-1β作用后细胞数量发生明显变化，而使用IL-1RA后数量未见明显变化。见图3。

2.4IL-1RA对IL-1β诱导水平的影响

IL-1β刺激人滑膜细胞后，ADAMTS4／5的表达量均高于对照组，使用IL-1RA抑制后，ADAMTS4和ADAMTS5的表达量均明显降低，结果显示IL-1RA可以降低IL-1β诱导水平。见图4。

3　讨论

OA的产生是一个多种因素共同参与作用的过程，目前治疗方法是使用以缓解疼痛及对抗炎症反应的药物与为主，如非甾体抗炎药或类固醇激素。但目前国内外尚无根治OA的方法，并且在治疗OA上存在许多争议，因此找到治疗OA的新靶点或者靶向治疗药物显得尤为重要。

研究［3］显示，在体外培养的正常人或动物的滑膜细胞中仅有少量的IL-1β，但是在人OA的滑膜组织提取的细胞上清液中却能检测出高表达的IL-1β。ADAMTS又被称作为蛋白聚糖酶，是国内外这些年克隆提取的新型酶类，属新的金属蛋白酶家族成员［4］，是带有凝血酶敏感蛋白样模体的裂解素。在白介素1家族中IL-1β与IL-1RI（白细胞介素1受体I型）的结和力最低，但IL-1RA与IL-1RI的结合力几乎不可逆转，因此IL-1RA被认为是IL-1β较为有效的抑制剂［5］。ADAMTS的家族成员中，特别是存在于人或动物软骨和滑膜组织中的蛋白聚糖酶1／2，又被分别称为ADAMTS4／5。被认为是可以降解关节软骨的一类。

研究［6－7］表明，IL-1对 ADAMTS5 mRNA的表达没有或仅有轻微影响。在动物实验方面用IL-1或维甲酸处理牛滑膜，并不改变ADAMTS4／5 mRNA的表达［2］。在人滑膜细胞培养中，Bondeson et al［8［9］报道在软骨细胞的培养中，用IL-RA可以阻滞IL-1和肿瘤坏死因子-α的诱导作用。本研究结果显示ADAMTS4／5在OA滑膜组织中均高表达；IL-1β可诱导人正常滑膜细胞的增殖，能够产生高表达的ADAMTS4／5；不同剂量的IL-1β作用滑膜细胞后，ADAMTS4表达量增加不明显，ADAMTS5表达的量逐渐增加，提示两种酶表达水平有差异；IL-RA能够抑制IL-1β诱导细胞蛋白表达，但因为没有设立精确时间点及IL-1β作用时间不同导致统计分析结果出现不一致。

研究［10－12］显示 p38-TAK1-NF-κB信号通路可能参与调节ADAMTS4／5的表达。由于经费及时间限制，未能进一步讨论。找出信号通路中的作用靶点和特异性抑制剂，为治疗OA提供新的依据显得尤为重要。在OA的研究中，仍有很多问题尚待解决。ADAMTS4和ADAMTS5在软骨中的表达及相关机制，在人体其他组织中蛋白聚糖酶起到的作用等均有待于进一步研究证实。

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Wang Jing，Zhang Qiqi，Hu Yong，et al
（Dept of Orthopedicst，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

中图分类号R 684．3

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1475－04

基金项目：国家自然科学基金（编号：81173075）

作者单位：1安徽医科大学第一附属医院骨科，合肥230022

作者简介：王京，男，硕士研究生；胡勇，男，博士研究生，副教授，责任作者，E-mail：hy．in163＠163．com术刀片剔除脂肪等非滑膜组织后，所取标本分为两组，所有标本袋上需注明患者详细信息。正常组（供细胞蛋白鉴定）和OA组（供组织蛋白鉴定）分别放置于无菌EP管及含生理盐水的标本袋中，后于－80℃冰箱冻存。

The expression and significance of thrombin-sensitive hormone protease4／5 in osteoarthritis synovial

AbstractObjectiveTo research the expression of thrombin sensitive hormone protease 4（ADAMTS4／5）in the OA synovial tissue and cells．Methods6 cases of OA synovial tissue and 6 cases of normal synovial tissue were taken during the operation．The expression quantity of specimen ADAMTS4／5 in cases wasmeasured by Western blot，respectively．The normal group and OA group synovial cellswere cultured in vitro．The normal group synovial cellswere induced by IL-1βor IL-1βblockers（IL-1RA）．The expression quantity of ADAMTS4／5 weremeasured by the supernatant fluid．ResultsADAMTS4／5 in OA synovial tissue expressed significantly than the normal group．The group of IL-1βwas obviously higher，IL-1RA could block IL-1βand induce synovial cells to produce ADAMTS4／5．ConclusionADAMTS4／5 and IL-1βplay an important role in synovial tissue inflammatory change；IL-1βcan be in accordance with the dose-responsemanner positive adjustment ADAMTS4／5 expression．

Key wordsosteoarthritis；ADAMTS4／5；IL-1β；IL-1RA；synovial cells