白芍总苷对糖尿病大鼠肝脏内质网应激的调节作用

夏玲玲，周仲松，谢琴秀，朱启金

白芍总苷对糖尿病大鼠肝脏内质网应激的调节作用

夏玲玲，周仲松，谢琴秀，朱启金

摘要目的探讨白芍总苷（TGP）对糖尿病大鼠肝脏损害的保护作用是否与抑制内质网应激（ERS）有关。方法建立链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病模型，随机分为对照组、模型组、TGP（50、100、200 mg／kg）给药组。应用油红O与Masson染色对肝组织行病理检查；采用免疫组化法检测肝组织ED-1表达；采用Western blot法检测GRP78、p-Perk及p-Eif2α的表达。结果TGP给药可降低糖尿病大鼠肝重增加及肝组织总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）及游离脂肪酸（FFA）水平。模型组肝细胞油红O染色评分明显高于对照组（P＜0．01）；TGP各给药组评分明显低于模型组（P＜0．01）。Masson染色模型组肝纤维化评分明显高于对照组（P＜0．01）；TGP 50、100、200 mg／kg给药组评分明显低于模型组（P＜0．01）。免疫组化显示模型组肝组织巨噬细胞浸润明显增加，各给药组均能抑制糖尿病肝组织巨噬细胞浸润的增加。Western blot显示糖尿病模型组肝组织GRP78、p-Perk及p-Eif2α表达明显高于对照组，TGP给药组肝组织GRP78、p-Perk及p-Eif2α表达明显低于模型组。结论TGP对糖尿病肝损害有明显保护作用，其机制可能与其抗炎、抑制ERS有关。

关键词糖尿病；肝脏；内质网应激；炎症；白芍总苷

高血糖肝脏损伤已成为非酒精性脂肪肝主要病因之一［1－2］。研究［3］表明巨噬细胞介导的炎症在糖尿病肝损伤中起重要作用。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是内质网未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）持续存在或超过ERS能力时的一种病理生理状态，近年研究［4－5］表明ERS可诱导炎症。白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）是我国传统中药白芍根中的提取成分，其药理作用有抗炎、抗氧化与免疫调节活性［6］。研究［7－8］表明TGP对糖尿病大鼠肾脏有明显保护作用，但对糖尿病肝脏的影响尚未见报道。该研究进一步从ERS角度探讨TGP对糖尿病肝脏保护作用机制。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1动物

雄性SD大鼠，体重280～300 g，安徽医科大学实验动物中心提供。在恒温22℃、相对湿度65%～70%、12 h光照／12 h黑暗环境中适应饲养1周后实验。

1．1．2药品与试剂

TGP由安徽医科大学临床药理研究所魏伟教授惠赠，用前溶于质量浓度为10 g／L的羧甲基纤维素钠溶液中；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自美国Sigma公司，临用前溶解于0．01 mmol／L枸椽酸缓冲液中，pH＝4．5；兔抗GRP78、p-Perk、p-Eif2α多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；小鼠抗大鼠ED-1单克隆抗体购自美国Millipore公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG购自武汉博士德公司；硝酸纤维膜购自美国Amersham公司；ECL发光试剂购自美国Pierce公司；即用型二步法免疫组化检测试剂盒（PV-9000）、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）试剂盒购自南京建成生物工程公司；三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒购自温州津玛生物科技公司。

1．2方法

1．2．1建立大鼠糖尿病模型

腹腔一次性注射STZ 60 mg／kg，48～72 h后测尾静脉血血糖＞16．7 mmol／L以上确定为糖尿病模型，对照组仅注射等量枸缘酸缓冲液。

1．2．2动物分组及处理

设对照组、模型组、TGP给药组（50、100、200 mg／kg灌胃）。每组10只。对照组、模型组给予等量溶媒。所有大鼠在整个实验期间喂标准饮食，自由饮水，不应用胰岛素。

1．2．3标本收集

观察8周后收集标本。大鼠空腹16 h后，在3%、0．1 ml／100 g体重剂量的戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右侧颈总动脉插管收集血标本，4℃、1 500 r／mim离心15 min，取血浆保存在－20℃待测血糖（blood glucose，BG）、TC、TG水平。通过右侧颈总动脉插管注入4℃预冷的生理盐

2015－05－25接收

1．2．4肝组织TC、TG及FFA含量测定

按试剂盒说明书进行。

1．2．5肝组织冰冻切片油红O染色

冰冻切片8μm水洗后置入密封容器盛装的脂肪染色剂内（稀释的油红染液染色）10～15 min；用60%乙醇溶液浸泡切片至细胞质为红色，底色呈白色为止；水洗；Harris苏木精淡染30 s；用1%磷酸氢二钠冲洗至变蓝；用塑料吸管附贴于载玻片上，稍干后甘油明胶封固。脂肪呈红色，胞核呈蓝色。

1．2．6肝脏病理学观察及评分标准

肝组织油红O染色脂肪沉积及Masson染色纤维化程度判定参照文献［9］。

1．2．7肝组织ED-1免疫组化

石蜡切片常规脱蜡，加入3%H2O2的甲醇封闭内源性过氧化酶；予微波炉暴露抗原，将切片浸入0．01 mmol／L枸橼盐缓冲液（pH＝6．0）；加小鼠抗大鼠ED－1单克隆抗体（1∶50）4℃过夜。漂洗后滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG（1∶200），漂洗后，滴加PV-9000。室温下滴加DAB显色液。水洗终止，Harris苏木精复染1 ～5 min，脱水后二甲苯透明，中性树脂封片。实验均采用删除第一抗体作内阴性对照。阳性物质呈棕色颗粒状，ED-1阳性结果判断参照文献［10］。

1．2．8Western blot法检测肝组织GRP78、p-Perk、p-Eif2α表达

将取出的100 mg肝组织放置于冰上，加入适量裂解液超声匀浆，4℃、12 000 r／mim离心30 min取上清液测蛋白浓度。取30 mg蛋白煮沸5min后，经6%～15%SDS-PAGE电泳，电转移至NC膜上，在5%脱脂奶粉-PBST溶液4℃封闭过夜，洗膜后加入免抗大鼠GRP78（1∶200）、p-Perk（1∶200）、p-Eif2α（1∶200）和β-actin（1∶500），4℃过夜，然后用HRP标记的二抗（1∶2 000）杂交，37℃、1 h。在暗室中加ECL发光试剂，X线片曝光1～2 min后显影、定影。杂交信号在图象分析系统中进行光密度扫描。应用β-actin作为蛋白上样量参照，其余组与其相比得到相对量，取均值。

1．3统计学处理

2　结果

表1　TGP对糖尿病大鼠体重、肝重、血糖及血脂的影响（n＝10，±s）

表1　TGP对糖尿病大鼠体重、肝重、血糖及血脂的影响（n＝10，±s）

与对照组比较：*P＜0．05，**P＜0．01；与模型组比较：＃P＜0．05

组别　　剂量（mg／kg）体重（g）肝重（g／100 g体重）BG （mmol／L）血TC （mmol／L）血TG （mmol／L）对照　　－　458±27．47　4．25±0．36　6．94±1．64　1．11±0．08　1．16±0．15模型　　－　271．75±16．86**　6．88±0．58**　31．97±4．19**　1．24±0．19*　1．70±0．16*TGP给药　50　281．75±25．01　5．12±0．42＃　30．62±4．35　1．22±0．12　1．68±0．13 100　266．4±27．87　4．68±0．36＃　32．05±4．24　1．19±0．13　1．64±0．14 200　318．0±17．8　4．56±0．40＃27．20±4．25　1．20±0．13　1．81±0．18

2.1TGP对糖尿病大鼠体重、肝重、血糖及血脂的影响

模型组体重明显低于对照组，模型组血糖、TC、TG及肝重明显高于对照组；TGP给药组体重、血糖及TC、TG水平无明显影响，可降低糖尿病肝重的增加。见表1。

2.2TGP对糖尿病大鼠肝组织TC、TG及FFA的影响

模型组肝组织TC、TG及FFA明显高于对照组，TGP给药组肝组织TC、TG及FFA低于模型组。见表2。

2.3TGP对糖尿病大鼠肝组织病理学影响

肝组织油红O染色可见肝细胞质中脂肪沉积，模型组肝细胞油红O染色评分明显高于对照组（2．67±0．86 vs0．42±0．16，P＜0．01）；各TGP给药组评分明显低于模型组（1．13±0．78、1．08±0．67、0．88±0．64 vs2．67±0．86，F＝13．12，P＜0．01）。见图1。Masson染色模型组大鼠纤维化评分明显高于对照组（1．86±0．64 vs 0．46±0．34，P＜0．01）；TGP 50、100、200 mg／kg给药组评分明显低于模型组（1．28 ±0．52、1．16±0．37、0．86±0．56 vs 1．86±0．64，F ＝6．45，P＜0．01）。见图2。

2.4TGP对糖尿病大鼠肝组织巨噬细胞浸润的影响

模型组肝组织ED-1表达明显高于对照组（2．64±0．86 vs 0．62±0．44，P＜0．01）；TGP 50、100、200 mg／kg给药组肝组织ED-1表达明显低于模型组（1．64±0．42、1．32±0．44、0．86±0．48 vs 2．64±0．86，F＝8．67，P＜0．01），模型组肝组织浸润的巨噬细胞体积较大，TGP给药后浸润的巨噬细胞体积较小。见图3。

表2　TGP对糖尿病大鼠肝组织TC、TG及FFA的影响（n＝10，±s）

表2　TGP对糖尿病大鼠肝组织TC、TG及FFA的影响（n＝10，±s）

与对照组比较：**P＜0．01；与模型组比较：＃P＜0．05

组别　　剂量（mg／kg）TG （mg／g）TC （mg／g）FFA （mg／g）－　7．10±0．46　7．45±0．42　1．32±0．16模型　　－　11．36±0．76**　9．48±0．88**　2．76±0．34**TGP给药　50　8．20±0．58＃　8．32±0．68＃　1．86±0．15＃100　7．78±0．52＃　7．79±0．65＃　1．74±0．16＃200　7．49±0．56＃　7．64±0．73＃　1．65±0．18对照＃

2.5TGP对糖尿病大鼠肝组织GRP78、p-Perk及p-Eif2α表达的影响

Western blot法显示模型组肝组织GRP78、p-Perk及p-Eif2α蛋白表达明显高于对照组（P＜0．01），TGP 50、100、200 mg／kg给药后肝组织GRP78、p-Perk及p-Eif2α蛋白表达明显低于模型组（P＜0．05，P＜0．01）。见图4～6。

3　讨论

目前国内外对糖尿病性脂肪肝（diabetic faty liver，DFL）干预作用的研究尚少，近年来，研究［11－13］表明TGP对化学性、酒精性和非酒精性、免疫性、药源性、生物性的多种肝损伤模型显示保护效应，但TGP对DFL保护作用尚未见报道。本研究表明TGP可降低糖尿病肝组织TC、TG及FFA水平，改善肝组织病理损害及脂肪浸润，并明显降低肝组织巨噬细胞浸润；TGP给药组巨噬细胞体积偏小，提示TGP可能抑制糖尿病肝组织巨噬细胞激活。

肝细胞代谢功能活跃，拥有数量丰富的内质网，内质网的功能紊乱势必对肝细胞功能造成影响进而导致疾病产生。非酒精性脂肪肝的发病过程中，大量的FFA在肝细胞内聚集，诱导肝细胞发生脂质过氧化，最后凋亡坏死，强烈的脂质过氧化是ERS的诱发因素。在高饱和脂肪酸喂养的Wistar大鼠发生肝脂肪变性后，ERS标志蛋白CHOP、GRP78、XBP-1表达增加，Caspase3蛋白活性增强［14］；在去除ERS通路中的ATF6α、eIF2α、IRE1α的小鼠表现为ERS失调，肝细胞脂肪变性，ERS蛋白合成恢复后，通过UPR通路活化作用，预防调节脂质代谢的代谢转录因子的产生，提示ERS可能是引起脂肪肝的基础［15－16］。

研究［4］表明ERS是代谢性炎症主要启动因素，如肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病等启动ERS，导致ERS的3条UPR通路被激活，UPR与炎症信号转导通路之间通过各种机制存在相互联系，包括核因子-κB和分裂原活化蛋白激酶的JUN N-末端激酶、ROS及内质网钙释放等。本研究表明糖尿病肝组织ERS相关蛋白GRP78、p-Perk及p-Eif2α蛋白表达明显增加，同时炎症巨噬细胞浸润也明显增多，提示ERS可能参与糖尿病肝损害过程中脂肪肝的发生及炎症机制的产生，TGP给药组肝组织GRP78、p-Perk及p-Eif2α蛋白表达明显降低，提示TGP可能通过抑制ERS对糖尿病肝组织发挥保护作用，但其详细机制尚需进一步研究。

综上所述，TGP对糖尿病肝损害有明显保护作用，其机制与抗炎、抑制ERS可能有关。

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中图分类号R 587．1；R 364．5

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1451－05

基金项目：安徽省自然科学基金（编号：1208085MH149）

作者单位：安徽医科大学第一附属医院感染病科，合肥230022

作者简介：夏玲铃，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：wuyonggui ＠medmail．com．cn水反复灌洗肝脏，至整个肝脏颜色变苍白后游离，置于冰上，取部分肝组织待测TC、TG及FFA含量，取8 mm×8 mm大小肝组织置于10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋后制成厚度为3μm的切片，行Masson染色。同时制4μm厚多聚赖氨酸处理切片，免疫组化检测。另取8 mm×8 mm大小肝组织 OCT包埋后制成8μm冰冻切片，油红O染色，剩余组织迅速放入－80℃冰箱待测。

Effect of total glucosides of paeony on endoplasm ic reticulum stress in streptozotocin-induced diabetic rats

Xia Lingling，Zhou Zhongsong，Xie Qinxiu，et al
（Dept of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo investigate prevention of early liver injury by total glucosides of paeony（TGP）in diabetic rats and whether itsmechanism was related to the inhibition of endoplasmic reticulum stress．MethodsTGP（50，100，200 mg／kg）was orally administered once a day for 8 weeks in STZ-induced diabetic rats．The levels of cholesterol，triglyceride and free fatty acid in liver tissue were determined by spetrophotometric method．Liver lesions were evaluated using oil red O and Masson staining．Expression of ED-1 was determined by immunohistochemistry and GRP78，p-Perk，p-Eif2αwere determined by Western blot analysis．ResultsTGP treatment in all three doses significantly reduced increased liver weight and liver lipid content in diabetic rats．Oil red O staining score in diabetic group was significantly higher than that in the control group（P＜0．01），TGP 50，100，200 mg／kg treatment group scoreswere significantly lower than those in the diabetic group（P＜0．01）．Masson staining showed hepatic fibrosis score wasmuch higher than that in the control group（P＜0．01），hepatic fibrosis scores in TGP 50，100，200 mg／kg treatment group were significantly lower than those in the diabetic group．Compared with the control group，immunohistochemistry showed thatmacrophage infiltration in the liver tissue from diabetic significantly increased，which was inhibited by TGP treatment in all three doses．Expressions of GRP78，p-Perk and p-Eif2αdetermined by Western blot in liver tissue of diabetic group were significantly higher than that in the control group，which also were decreased by TGP administration（50，100，200 mg／kg）．ConclusionOur results indicate that TGP has potential as a treatment for diabetic liver injury through attenuating liver lipid accumulation and inflammation as well as ERS induced by diabetic condition．

Key wordsdiabetes；liver；endoplasmic reticulum stress；inflammation；total glucosides of paeony