丙戊酸钠参与脊髓水平疼痛－瘙痒调控的研究

高　洁，鲁显福，，陈家骅，张励才，刘　鹤

丙戊酸钠参与脊髓水平疼痛－瘙痒调控的研究

高洁1，鲁显福1，2，陈家骅3，张励才2，刘鹤2

摘要目的探讨丙戊酸钠（VPA）对小鼠坐骨神经分支高选择结扎切断（SNI）引起的神经病理性疼痛与氯喹诱发的急性瘙痒的影响。方法实验一：将昆明种雄性小鼠48只随机分为6组：神经病理性疼痛组（SNI）、假手术组（Sham）、瘙痒组（CQ）、瘙痒溶媒组（NS）、疼痛瘙痒组（SQ）及空白对照组（CON）；CON、SNI、Sham、SQ组在术前1 d，术后1、3、5、7、9、10 d测定左后足机械痛阈值（MWT），CON、CQ、NS、SQ组分别于右后足足底注射氯喹或生理盐水后观察小鼠舔足时间。实验二：昆明种雄性小鼠16只随机分为SQ-V组和SQ-N组。SNI模型分别于术后5、6、7、8、9 d早晚8时注射VPA（SQ-V组）及VPA溶媒生理盐水（SQ-N组）后测定疼痛行为学，于术后第10天注射氯喹后观察瘙痒行为学。行为检测结束后使用反转录PCR（RT-PCR）法检测脊髓L4-L6部位组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）的表达。结果SNI组及SQ组在术后1 d MWT降低（P＜0．05），第5天仍在较低水平。SQ-V组较SQ-N组鞘注后MWT显著升高（P＜0．05）。CQ组较NS组舔足时间显著延长，SQ组舔足时间明显低于CQ组（P＜0．05）。SQ-V组舔足时间显著高于SQ-N组（P＜0．05）。RT-PCR结果提示SNI引起HDAC2表达上调，CQ引起HDAC2表达下调。结论疼痛能够抑制瘙痒神经信号传导，脊髓水平HDAC2差异性表达介导疼痛－瘙痒的共同调节。

关键词脊髓；丙戊酸钠；神经病理性疼痛；瘙痒；氯喹

疼痛与瘙痒是躯体对内源性或外源性刺激产生的两种不同的躯体感觉，虽然二者之间的信号转导以及神经环路仍然没有明确的定论，但疼痛抑制瘙痒，疼痛的缓解可能引起瘙痒的观点已被广泛接受［1］。现临床上广泛使用的组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂，可通过减少HDAC的表达抑制组蛋白的去乙酰化发挥内源性镇痛作用［2］。本课题组的前期研究（待发表）显示非特异性HDAC抑制剂丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）抑制脊髓水平HDAC2的表达，虽可显著缓解神经损伤引起的痛觉过敏，但同时会引起剧烈的瘙痒行为学表现。该研究基于疼痛与瘙痒之间的关系，探讨VPA是否也通过HDAC2调控脊髓水平瘙痒感觉，进而参与脊髓水平疼痛－瘙痒的共同调节，以期为临床合理用药提供有价值的指导意见。

1　材料与方法

1．1实验动物

成年SPF级昆明种小鼠，雄性，重20～25 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。动物饲养于（24±1）℃和12 h光照／12 h黑暗的昼夜节律，自由摄食摄水。

1．2试剂与主要仪器

注射用VPA［赛诺菲（杭州）制药有限公司，批号：A2270／2CA45］；水合氯醛、生理盐水（上海制药厂）；氯喹（美国Sigma-Aldrich公司）；反转录PCR（RT-PCR）试剂盒（美国Invitrogen公司）；Electron Von Frey（美国IITC公司）；视频记录仪（日本Olympus公司）；罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）。

1．3方法

1．3．1实验分组

实验一：将昆明种雄性小鼠48只随机分为6组：神经病理性疼痛组（SNI组）、假手术组（Sham组）、瘙痒组（CQ组）、瘙痒溶媒组（NS组）、疼痛瘙痒组（SQ组）及空白对照组（CON组）；CON、SNI、Sham、SQ组在术前1 d、术后1、3、5、7、9、10 d测定左后足机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT），CON、CQ、NS、SQ组分别注射氯喹或生理盐水后观察小鼠舔舐右后足的时间。实验二：昆明种雄性小鼠16只随机分为SQ-V组和SQ-N组。SNI模型分别于术后5、6、7、8、9 d早晚8时注射VPA（SQ-V组）及VPA溶媒生理盐水（SQ-N组）2次后测定疼痛行为学，于术后第10天测定MWT后注射氯喹，观察瘙痒行为学表现。

1．3．2建立SNI动物模型［3］

成年昆明种小鼠经

2015－06－29接收

2江苏省麻醉学重点实验室，徐州221004

1．3．3鞘内注射的操作方法［2］

左掌压住鼠身，拇中二指按压骼骨两侧固定，食指按在双侧骸骨前缘连线正中点皮肤上（可触知L5棘突）指示进针位点，右手持10μl微量进样器与脊柱上方约成20°角于L5-L6间隙进针，针尖进入一侧棘突、横突间组织后减10°角左右缓慢推进，以鼠尾出现突然侧向运运为成功标志（可能系触及相应运动神经所致），按5 mg／kg［4］剂量注射容积5μl VPA或VPA溶媒生理盐水，时间约5 s，然后缓慢拔出。注意进针深度约4 mm，针头斜面向下，针尖触及椎骨有抵挡感。

1．3．4MWT的测定［5］

用Electron Von Fery测定小鼠的MWT。将小鼠置于透明的有机玻璃箱中，底为0．5 cm×0．5 cm孔径的铁丝网，待小鼠在有机玻璃箱中适应30min后，Electron Von Frey Rigid tip垂直正确安置在测定架上，空载条件下调零。刺激小鼠左侧足底，即时读数至抬腿或主动缩足，观察最大折力数据（用g表示），以此作为机械刺激疼痛敏感指标之一。每组动物每个时间点连续测5次取平均值。观察并记录各组间及组内的MWT差异。

1．3．5舔足时间［6］的检测

使用视频记录仪记录小鼠的舔足时间，即小鼠用舌头舔舐右后肢踝关节以下部位的总时间（用s表示）。将小鼠先放置于有机玻璃箱中适应30 min，随后在小鼠右侧足底皮内注射200μg／10μl氯喹或10μl氯喹溶媒，立即放回玻璃箱中，并打开视频记录仪记录注射后30 min内的舔足时间，记录期间实验操作人员离开实验操作间。实验结束后，回放视频计算小鼠舔足时间。

1．3．6RT-PCR法检测

取各组小鼠脊髓L4－L6部位，液氮研磨，TRIzol提取总RNA后M-MLV逆转录酶合成cDNA。采用Light Cycler 480 SYBR Green IMaster试剂检测小鼠脊髓L4－L6部位HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8基因的相对表达量，实验独立重复3次。

表1　引物序列

1．4统计学处理

采用Graph PAD Prism 5．0软件对实验数据进行统计分析，并生成统计图表。计量资料以±s表示。多组比较采用One-Way ANOVA，两两比较采用Student′s t检验，机械缩足阈值采用Two-Way ANOVA（时间为组内因素，处理为组间因素）分析，RT-PCR结果采用秩和检验进行比较。

2　结果

2.1SNI对疼痛行为学的影响

SNI小鼠术后1 d 起MWT较CON组小鼠MWT明显降低（F＝109．56，P＜0．05），至第5天后仍处于较低水平，见图1。

2.2正常及SNI小鼠对氯喹或NS的反应

CQ组小鼠舔足时间较NS组舔足时间显著延长，SQ组舔足时间明显低于CQ组（F＝205．64，P＜0．05）。SQ-V组舔足时间显著高于SQ-N组（F＝209．58，P ＜0．05），见图2。

2.3VPA对于SNI小鼠疼痛－瘙痒行为的影响

连续5 d鞘内注射VPA可以显著缓解SNI引起的MWT下降（F＝110．78，P＜0．05），但会引起小鼠舔足时间的明显延长（F＝209．78，P＜0．05），见图3、4。

2.4HDAC2在疼痛以及瘙痒条件下的表达

RTPCR结果提示HDAC2在神经病理性疼痛条件下表达明显上调（Z＝4．532 7，P＜0．05），而在瘙痒条件下，HDAC2表达明显下调（Z＝5．074 3，P＜0．05），见图5。

3　讨论

本课题组前期研究（待发表）仅偶然观察到VPA在缓解神经损伤引起的疼痛的同时会引起剧烈瘙痒，该研究在此基础上，进一步在分子水平上证实HDAC2也同时参与脊髓水平瘙痒感觉的调节，进而可以明确HDAC2参与脊髓水平疼痛－瘙痒的共同调节。

SNI模型具有机械痛敏产生早、个体差异性小、持续时间长，术后可出现显著的机械痛觉异常，保留腓肠神经、不影响小鼠日常活动等优点，便于精确衡量镇痛药物引起的神经病理性疼痛的行为学表型变化。瘙痒模型独创性的建立在与疼痛模型相同的脊髓节段，减少了传统的颈背部注射氯喹诱导瘙痒模型［1］的混杂因素，可以更好的解释相同节段脊神经的交互支配作用。

HDAC分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4大类，I类包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8；Ⅱ 类包括HDAC4、HDAC5、 HDAC6、HDAC7、 HDAC9、HDAC10；Ⅲ类包括Sirt1～Sirt7；Ⅳ类包括HDAC11。Liang et al［7］已经证实HDAC2表达的上调参与脊髓水平痛觉过敏的形成。RT-PCR实验中，本课题组重点关注Ⅰ类HDAC，选取Ⅰ类HDAC进行RT-PCR实验，研究显示Ⅰ类HDAC中仅HDAC2在疼痛模型中表达显著上调，在瘙痒模型中表达显著下调，证实了课题组的前期推测。

Liu et al［8］最早证明瘙痒的发生与脊髓水平的μ阿片受体（μopioid receptor，MOR）有关，并同时发现了与瘙痒相关的特异性受体胃泌素受体释放肽（GRPR）。深入研究后显示MOR存在不同的受体亚型，并发现疼痛的调节与MOR1亚型有关，瘙痒与MOR1D亚型有关，MOR1D通过与GRPR形成异二聚体而引起强烈的瘙痒感觉。

阿片受体是与痛觉过敏相关的经典受体，笔者推测，脊髓水平HDAC2的差异性表达可引起脊髓水平不同亚型阿片受体的差异性表达，即MOR1表达下调引起疼痛的减轻；MOR1D表达上调，使得MOR1D-GRPR异二聚体增多进而诱发瘙痒感觉的产生，但确切机制还有待进一步研究。

综上所述，通过外源性使用非特异性HDAC抑制剂VPA干预SNI引起的神经病理性疼痛，显示VPA在缓解神经病理性疼痛时会引起瘙痒，提示HDAC2参与脊髓水平疼痛－瘙痒的共同调节，但详细机制有待进一步研究。

参考文献

［1］Liu Q，Tang Z，Surdenikova L，et al．Sensory neuron-specific GPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-induced pruritus［J］．Cell，2009，139（7）：1353－65．

［2］Denk F，Huang W，Slidders B，et al．HDAC inhibitors attenuate the development of hypersensitivity in models of neuropathic pain ［J］．Pain，2013，154（9）：1668－79．

［3］Decosterd I，Woolf C J．Spared nerve injury：an animalmodel of persistent peripheral neuropathic pain［J］．Pain，2000，87（2）：149－58．

［4］Hylden J L，Wilcox G L．Intrachecal morphine in mice：a new technique［J］．Eur JPharmacol，1980，67（2－3）：313－6．

［5］汤黎黎，陈家骅，鲁显福，等．脊髓水平TRPM8激活参与疼痛－瘙痒共病的研究［J］．安徽医科大学学报．2014，49（11）：1562－5．

［6］Akiyama T，CarstensM I，Carstens E．Spontaneous itch in the absence of hyperalgesia in a mouse hindpaw dry skin model［J］．Neurosci Lett，2010，484（1）：62－5．

［7］Liang D Y，Li X，Clark D．Epigenetic regulation of opioid-induced hyperalgesia，dependence，and tolerance in mice［J］．J Pain，2013，14（1）：36－47．

［8］Liu X Y，Liu ZC，Sun YG，etal．Unidirectional cross-activation of GRPR by MOR1D uncouples itch and analgesia induced by opioids［J］．Cell，2011，147（2）：447－58．

中图分类号R 394；R 361；R 745；R 961

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1418－05

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（编号：81100813、81300957）；江苏省教育厅高校省级重点实验室开放课题（编号：KJS1101）

作者单位：安徽医科大学第一附属医院1麻醉科、3疼痛科，合肥230022

作者简介：高洁，男，硕士研究生；鲁显福，男，副教授，副主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：lxf001＠126．com；陈家骅，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：Chenjiahua001＠sina．com10%的水合氯醛麻醉后，切开左后肢侧面皮肤，钝性分离股二头肌，暴露坐骨神经及其3个分支（胫神经、腓总神经和腓肠神经），分别双重结扎胫神经和腓总神经，在双重结扎中央切断，并分别去除末端2～4 mm的神经干，术中避免直接接触或者牵拉腓肠神经，保持其完整性。术后分层缝合伤口，抗生素抗炎处理。Sham组则只暴露坐骨神经及其分支而不切断。其余处理方式同手术组。

Sodium valproate involves in regulation of pain and itching in spinal cord

Gao Jie1，Lu Xianfu1，2，Chen Jiahua3，et al
（1Dept of Anesthesiology，3Dept of Pain，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022；2Jiangsu Key Laboratory of Anesthesiology，Xuzhou221004）

AbstractObjectiveTo investigate the impactof VPA on pain behavior induced by SNIand itch behavior evoked by chloroquine．MethodsExperiment 1：forty-eightmale KM mice were random ly divided into SNIgroup，Sham group，CQ group，NS group，pain，SQ group and CON group．Pain threshold（MWT）of the left hindpaw was measured 1 day before and 1，3，5，7，9，10 day after operation in CON，SNI，Sham and SQ group．The licking time was observed after chloroquine or saline injection into the plantar surface of the right hindpaw in CON，CQ，NS and SQ group．Experiment two：sixteen male KM mice were random ly divided into SQ-V group and SQ-N group．Pain behaviors weremeasured after injection of VPA（SQ-V）and vehicle（SQ-N）at8 AM and 8 PM on 5，6，7，8，9 day after SNIoperation．Itching behaviorwas observed after injection of chloroquine on the 10th day after SNIoperation．The expression of histone deacetylase 2（HDAC2）in spinal L4-L6 was detected by RT-PCR after behavior testing．ResultsMWT following SNI was significantly lower（P＜0．05）1 day postoperation and reached the peak on the 5th day postoperation in SNI group and SQ group．MWT was significantly higher（P＜0．05）after intrathecal injection in SQ-V group than in SQ-N group．Licking time was significantly longer in CQ group than in NS group，and licking time was significantly shorter in SQ group than in CQ group（P＜0．05）．Licking time was significantly longer in SQ-V group than in SQ-N group（P＜0．05）．The results of RT-PCR indi-cated that the expression of HDAC2 was upregulated after SNIand downregulated after CQ injection．Conclusion Pain can suppress the transmitting of itching signal，and differential expression of HDAC2 contributes to co-regulation of pain and itching in spinal cord．

Key wordsspinal cord；sodium valproate；neuropathic pain；itch；chloroquine