一种新型改良硫氧还蛋白融合表达体系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表达

鲁一灵，高久香，乔雪，王义鹏，于海宁



一种新型改良硫氧还蛋白融合表达体系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表达

鲁一灵1，高久香1，乔雪1，王义鹏2，于海宁1

1 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116024 2 苏州大学药学院，江苏苏州 215123

鲁一灵, 高久香, 乔雪, 等. 一种新型改良硫氧还蛋白融合表达体系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表达. 生物工程学报, 2015, 31(3): 403–410.Lu YL,Gao JX, Qiao X, et al. Construction of novel thioredoxin fusion protein expression system and the production of recombinant Lf-CATH2. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 403–410.

通过改良硫氧还蛋白融合表达体系，原核表达cathelicidin家族抗菌肽Lf-CATH2。首先在Lf-CATH2基因上游加入凝血酶位点，并去除pET32α载体的凝血酶序列和S标签序列，构建优化的Lf-CATH2-pET32α-TS载体，于大肠杆菌中表达。产物融合蛋白经凝血酶切割释放Lf-CATH2，纯化后进行抗菌活性检测。结果表明改良的硫氧还蛋白融合表达体系显著提高酶切效率达37%，Lf-CATH2在新体系中获得了可溶性高表达，且保留了抗菌活性。因此该新型硫氧还蛋白融合表达体系，有望为cathelicidin家族及其他阳离子活性肽提供更好的原核表达载体工具。

cathelicidin，Lf-CATH2，硫氧还蛋白融合表达，凝血酶切割

Cathelicidins是一类由生物体基因组编码的，包括人类在内的大多数脊椎动物所特有的宿主防御肽，由N端信号肽区域、中间保守cathelin结构域和C端高度特异的成熟肽区域构成，在动物先天免疫系统中发挥极其重要作 用[1-3]。除了广谱抗菌活性，cathelicidins还具有其他重要生物学功能，如趋化多种免疫细胞、诱导肥大细胞脱颗粒和组胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等[4-7]。Cathelicidins不仅对普通革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及病毒具有非常强的抗性，而且对许多临床耐药菌株同样具有作用[8-9]。Cathelicidins由于其特殊的杀菌机理，不易产生耐药性，且结构简单，没有二硫键，相比其他家族抗菌肽溶血性和细胞毒性小，因此极具开发潜力[10-13]。

在前期工作中，从两栖类的脆皮大头蛙体内克隆到两条新型cathelicidin序列，成熟肽分别是Lf-CATH1和Lf-CATH2。化学合成的Lf-CATH2对G+菌、G-菌以及真菌具有很好的广谱抗菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌，其MIC仅为8.3 μg/mL[14]。为进一步探讨Lf-CATH2用于抗感染治疗的可行性，构建了新型改良的硫氧还蛋白融合表达系统，提高了酶切效率，实现了在大肠杆菌细胞裂解上清液中高效表达Lf-CATH2。通过镍柱亲和层析纯化融合蛋白；使用凝血酶切割释放Lf-CATH2，对纯化后的可溶性Lf-CATH2进行生物学活性鉴定，为以后大量生产及临床应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞与质粒

表达质粒pET-32α、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21 (DE3)菌株为本实验室保存。

1.1.2 引物

引物 (表1) 合成和测序均由生工生物工程(上海) 有限公司完成。

1.1.3 试剂

DNA限制性内切酶 (Ⅰ、RⅠ、Ⅰ、Ⅱ)、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶和DNA marker购自宝生物工程(大连) 有限公司；Protein marker购自全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 购自Merck Serono China公司；小牛凝血酶购自美国Sigma公司；Tris、甘氨酸和聚丙烯酰胺购自Amresco公司；HisTrapTMFF镍柱购自GE Healthcare公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 克隆含有凝血酶序列的基因

以基因为模板，使用引物1和2，对Lf-CATH2编码基因进行PCR扩增。引物1、2分别包含Ⅰ酶切位点和凝血酶位点序列，以及RⅠ酶切位点。PCR反应体系：10×PCR 缓冲液(Mg2+Plus) 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，引物1和2 (20 μmol/L) 各1 μL，模板DNA 1 μL，DNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，加灭菌蒸馏水至50 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共28个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应结束后，产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的基因，连接T载体转化测序验证。

表1 用于Lf-CATH2基因扩增和载体修饰的引物序列

The italic and bold sequence is thrombin site; the underlined sequences are restriction sites, with the name under the sequence; the lowercase sequences are part of-.

1.2.2 Lf-CATH2-pET32α-TS融合表达载体的构建

如图1所示，使用引物3、4以载体pET32α为模板进行PCR扩增，得到从Ⅰ到Ⅱ，去除了凝血酶和S标签的pET32α载体小片段，再以Ⅰ和Ⅱ对pET32α双酶切得到载体大片段。将得到的大小片段分别双酶切后连接，转化大肠杆菌DH5α，选取目的阳性克隆测序确定无误。以Ⅰ和RⅠ酶分别双酶切上述载体及引物1和2克隆产物，回收、连接、转化入大肠杆菌DH5α，进行菌落PCR，选取目的阳性克隆，氨苄青霉素半固体LB培养基穿刺培养送样测序。由此，表达的融合蛋白将仅含有一个凝血酶切割位点。

1.2.3 Lf-CATH2-pET32α-TS融合蛋白的诱导表达与鉴定

将含有重组质粒Lf-CATH2-pET32α-TS的单菌落接种于含氨苄的LB培养基中，37 ℃培养至对数期，以1∶100接种于相同培养基，培养至对数期，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，诱导4 h，4 ℃离心(5 000 r/min)10 min收集菌体。菌体沉淀(~4.5 g) 溶解于30 mL磷酸盐缓冲液 (0.1 mol/L，pH 7.4) 中，冰浴超声破碎30 min，破碎条件为：400 W，破碎5 s，间隔5 s。待菌液由浑浊变清澈透亮时，将悬浮液于4 ℃， 14 000 r/min离心30 min，分别收集上清及沉淀，加1×SDS上样缓冲溶液混匀，煮沸，离心取上清进行SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况，确定融合蛋白在细胞中的表达部位。

图1 重组优化载体改造图

1.2.4 Lf-CATH2-pET32α-TS融合蛋白的分离纯化

收集1 L经IPTG诱导后的菌液离心，PBS洗涤，重悬，冰浴超声破碎，离心收集上清溶液，0.22 μm滤膜过滤后加入平衡好的ÄKTA HPLC System上的HisTrapTMFF镍柱，流速1 mL/min。用含60 mmol/L咪唑的缓冲溶液洗脱杂蛋白 (1 mL/min)，至280基线稳定后，用含300 mmol/L咪唑的缓冲溶液对融合蛋白进行洗脱、收集。采用Bradford检测法测定融合蛋白浓度，根据标准曲线，计算1 L菌液中融合蛋白的含量。

1.2.5 Lf-CATH2的释放和纯化

以Tris缓冲液 (pH 8.0)溶解凝血酶，25 ℃切割18 h后，进行SDS-PAGE电泳鉴定。用C18柱 (Hypersil BDS C18, 30×0.46 cm) RP-HPLC纯化。以均含有1%三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA) 的去离子水和乙腈，作为流动相线性梯度洗脱 (1 mL/min)，214 nm检测吸收峰。收集目的蛋白，使用Bradford检测法测定目的蛋白浓度，保存于−20 ℃中，供活性测定使用。

2 结果

2.1 重组优化载体Lf-CATH2-pET32α-TS的构建

测序结果显示成功构建了去除凝血酶和组氨酸标签的优化载体pET32α-TS。使用引物1、2扩增含有凝血酶和酶切位点的(171 bp)目的基因。将目的基因片段和优化载体经Ⅰ和RⅠ双酶切后连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆进行菌落PCR。分别使用引物1、2和3、4进行菌落PCR鉴定，条带大小与理论值171 bp (图2，泳道1)、432 bp (不含有凝血酶和组氨酸标签，图2，泳道2)吻合。同时筛选阳性克隆菌测序，结果表明重组优化载体Lf-CATH2-pET32α-TS被正确构建。

图2 重组优化载体菌落PCR电泳图

2.2 融合蛋白表达鉴定

SDS-PAGE表明含有Lf-CATH2-pET32α-TS的工程菌经过IPTG诱导后，表达产物在20 kDa附近出现了一条明显的新条带，与理论相对分子质量19.3 kDa相符(图3，泳道2)，未经诱导表达的工程菌，无明显条带(图3，泳道1)。相同条件下诱导未优化载体菌Lf-CATH2-pET32α (图3，泳道3) 和优化载体菌Lf-CATH2- pET32α-TS(图3，泳道4)。前者理论表达蛋白约22kDa，灰度扫描软件分析显示其表达量仅约占菌体总蛋白的21.4%，而优化载体Lf-CATH2- pET32α-TS表达量约占菌体总蛋白的46.2%，为未优化载体的2倍以上，表明含有优化质粒的工程菌为高效工程菌。

图3 不同条件下菌体全蛋白的表达情况

2.3 融合蛋白的纯化

收集菌体，破碎离心后分别取细胞裂解上清 (图4，泳道2)、沉淀 (图4，泳道3) 进行电泳检测，显示融合蛋白大多为可溶性表达(图4)。1 L含pET32α-Lf-CATH2-TS重组质粒的菌液经IPTG诱导后，收集菌体裂解上清液，通过ÄKTA HPLC System镍柱纯化融合蛋白，采用Bradford检测法测定融合蛋白浓度为487.8 mg/L。

2.4 目的蛋白释放、纯化与活性鉴定

凝血酶切割位点位于R与G之间：LVPR-GS，优化载体融合蛋白切割后产生大小两个片段，理论分子量分别为14.4 kDa与4.9 kDa(图4，泳道4)；未优化载体表达融合蛋白切割大小两片段分别为13.9 kDa和8.0 kDa (图4，泳道5)。将优化和非优化酶切释放蛋白 (图4，泳道4、5下方箭头所指条带) 进行灰度扫描，结果显示优化后凝血酶切割效率提升约37%。

凝血酶切割产物经过ÄKTA HPLC System镍柱纯化去除切割大片段和未成功切割片段，收集目的产物经RT-HPLC纯化，约27 min出现明显单一吸收峰，如图5箭头所示，且在线性洗脱梯度范围内无明显杂峰出现，说明RT-HPLC纯化所得的目标蛋白纯度较高。对纯化后的Lf-CATH2进行金黄色葡萄球菌MIC检测，其值可达8.3 μg/mL。

图4 重组优化载体全蛋白、裂解上清液、包涵体及融合蛋白切割后的SDS-PAGE分析

图5 RT-HPLC纯化目的肽Lf-CATH2

3 讨论

抗菌肽由于其自身特点，如带正电，大多数为线性分子(含有的二硫键桥不稳定)，自身又是一种天然杀菌剂，极易被宿主体内的酶降解等特性，很大程度上限制了其在宿主菌中的表达[15-17]。而硫氧还蛋白原核表达系统产生的融合蛋白，类似于抗菌肽前体结构，大大增加了抗菌肽的稳定性和隐藏了抗菌肽的毒性[15,18-20]。为了高效、低成本制备Lf-CATH2，本实验选用硫氧还蛋白融合表达系统进行改造，它特别适用于在大肠杆菌中高产量表达可溶性蛋白质，从实验结果显示，大部分Lf-CATH2融合蛋白为可溶性表达，使得后续纯化步骤变得简便。

对于融合表达来说，酶切位点的选择也至关重要，正确而高效地切割能够促进多肽正确折叠和二硫键的形成[19,21-24]。pET32α载体常应用于阳离子抗菌肽的融合表达，但有数据显示载体自身携带的凝血酶位点和S标签可能阻碍凝血酶的切割，不利于目的肽的释放[25]。原因可能是表达体系中的酶切位点受邻近残基的影响，或者由于目的肽链的聚集使得凝血酶切割位点隐藏，很难与酶接触，致使切割效率不高，即使两个凝血酶位点都能暴露出来，对于切割下来的额外片段也会增多，不利于目的蛋白纯化[19,26]。因此我们优化了pET32α载体，去除了S标签与凝血酶位点，而在序列前加入凝血酶位点，连接到优化载体进行融合表达。诱导表达的融合蛋白在菌体总蛋白中含量高，经过凝血酶切割，镍柱和RT-HPLC纯化后得到的Lf-CATH2仍然显示较强的抗菌活性。本实验构建的新型的硫氧还蛋白原核表达系统，有效解决了原始载体酶切效率低下的问题，有望成为cathelicidin家族及其他阳离子抗菌肽的高效原核表达工具。

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(本文责编 郝丽芳)

Construction of novel thioredoxin fusion protein expression system and the production of recombinant Lf-CATH2

Yiling Lu1, Jiuxiang Gao1, Xue Qiao1, Yipeng Wang2, and Haining Yu1

The objective of this study was to construct an improved thioredoxin fusion protein expression system, and express the cathelicidin-derived peptide, Lf-CATH2. The improved fusion vector Lf-CATH2-pET32α-TSwas successfully constructed by firstly deleting the thrombin site and S tag from the pET-32α vector, then inserting the Lf-CATH2 plus a thrombin site instead. Afterwards, Lf-CATH2 was expressed inas fusion protein. After the cleavage by thrombin, Lf-CATH2 was released and subsequently separated using affinity chromatography. The antimicrobial activity of purified Lf-CATH2 was also examined. The improved expression vector significantly increased enzyme cleavage efficiency by 37%, and Lf-CATH2 could be expressed in high yield and maintain the biological activity. This novel thioredoxin fusion protein expression system enables a quick production of high-yield bioactive cationic peptides like cathelicidins.

cathelicidin, Lf-CATH2, thioredoxin fusion protein, thrombin cleavage

April 17, 2014; Accepted:October 27, 2014

Haining Yu. Tel/Fax: +86-411-84708850; E-mail: joannyu@live.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 41206153), Growth Project for Liaoning Distinguished Young Scientists of Colleges and Universities (No. LJQ2013010), Dalian Distinguished Young Scientists Foundation (No. 2013J21DW013).

国家自然科学基金(No. 41206153)，辽宁省高等学校杰出青年学者成长计划(No. LJQ2013010)，大连市优秀青年科技人才基金(No. 2013J21DW013) 资助。