吡那地尔对癫痫持续状态大鼠海马神经元保护作用及对Bcl-2和Caspase3表达的影响

袁晶晶,郑辑英,李光来,薛村水,薛国芳,张晓敏

吡那地尔对癫痫持续状态大鼠海马神经元保护作用及对Bcl-2和Caspase3表达的影响

袁晶晶1,郑辑英2,李光来2,薛村水2,薛国芳2,张晓敏2

目的研究吡那地尔对癫痫持续状态(SE)大鼠海马神经元保护作用及可能机制。方法随机将96只大鼠分成N组、SE组、Pin组、Gli组,每组按SE后12 h、24 h、72 h、5 d分为4亚组,用LiCl-PILO法进行SE动物造模,采用SABC检测Bcl-2、Caspase-3,TUNEL法检测凋亡细胞。结果N组TUNEL阳性细胞、Bcl-2及Caspase-3均有基础表达。SE组、Pin组、Gli组TUNEL阳性细胞均在72 h达峰值、Caspase-3均在24 h达峰值。同时间点比较,SE组、Pin组、Gli组较N组均明显增多(P<0.05); Pin组较SE组、Gli组均明显减少(P<0.05);SE组与Gli组比较差异无统计学意义(P>0.05)。SE组、Pin组、Gli组Bcl-2均在12 h达高峰。同时间点比较,SE组、Pin组、Gli组较N组均明显增多(P<0.05);Pin组较SE、Gli组均明显减低(P<0.05);SE组与Gli组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论吡那地尔可上调Bcl-2表达,抑制Caspase-3释放,对SE大鼠有脑保护作用,格列吡嗪拮抗吡那地尔此作用。

癫痫持续状态;吡那地尔;Bcl-2;Caspase-3

癫痫持续状态(status epilepticus,SE)为神经科常见急症之一,指癫痫连续发作间意识未完全恢复又频繁发作,或发作时间持续30 min以上不能自行停止。反复癫痫发作或SE会造成脑损伤[1,2],凋亡在这种脑损伤中起重要作用[3,4]。近年来,ATP敏感性钾通道(ATP sensitive K+channels,KATP)开放剂对癫痫的脑保护作用成为研究热点。本实验通过吡那地尔(pinacidil)及格列吡嗪(glipizide)干预SE大鼠,观察TUNEL阳性细胞、Bcl-2及Caspase-3指标,探讨pinacidil对SE大鼠海马神经元保护作用,为临床治疗癫痫提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 材料 雄性健康Wistar大鼠96只(体重190g～250g、鼠龄3个月～4个月)由山西医科大学实验动物中心提供;氯化锂(LiCl)由中国医药集团公司提供;匹罗卡品(PILO)、吡那地尔、格列吡嗪由美国Sigma公司提供;TUNEL、SABC试剂盒、Bcl-2及Caspase-3抗体、DAB显色剂由武汉博士德试剂公司提供;余试剂均为市售分析纯品。

1.2 动物造模及分组 随机将96只大鼠分成对照组(N组)、癫痫组(SE组)、吡那地尔组(Pin组)、格列吡嗪组(Gli组),每组按SE后12 h、24 h、72 h、5 d分为4个亚组,每组6只大鼠。所有大鼠腹腔注射LiCl 125 mg/kg,SE组大鼠20 h后腹腔注射PILO 30 mg/kg; Pin组于注射PILO前30 min腹腔注射吡那地尔(10 nmol/5μL)10μL;Gli组于注射PILO前50 min腹腔注射格列吡嗪(1μmol/5μL)10μL,隔20 min后予吡那地尔(10 nmol/5μL)10μL腹腔注射;N组、SE组、Pin组于相应时间点腹腔注射等量生理盐水。观察大鼠行为变化,依据Racine评分标准判定癫痫发作级别,达Ⅳ级～Ⅴ级发作归于实验组,不符合模型或死亡者应剔除并补充相应数目大鼠保证样本量。癫痫发作持续30 min以上者为SE发作,SE达1 h后腹腔注射地西泮10 mg/kg终止发作。

1.3 标本处理 实验组大鼠用10%水合氯醛(100 mg/kg)深度麻醉,断头取出脑组织置于4%多聚甲醛液中固定,经脱水、透明、浸蜡及包埋后,在视交叉后海马区连续冠状切片(厚约5μm),隔15张连续取4张片,做4套分别行HE染色及三项指标检测。

1.4 凋亡细胞检测 按TUNEL试剂盒说明书操作,观察到凋亡细胞的胞核中含棕黄色颗粒物。

1.5 Bcl-2、Caspase-3检测 按试剂盒操作,用SABC法(链酶亲和素-生物素过氧化酶连接法)、DAB染色,胞浆或者核膜着色呈现棕黄色为Bcl-2阳性细胞;胞浆或胞核内含有棕黄色沉淀物为Caspase-3阳性细胞。

1.6 结果处理 平均每张切片取5个视野,算出每个视野的Bcl-2、Caspase-3、TUNEL阳性细胞数并计算其平均数。

1.7 统计学处理 计量资料用均数±标准差(x±s)表示,用SPSS21.0统计软件行析因方差分析,P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SE大鼠行为学观察 除N组无癫痫发作外,其他实验组大鼠在腹腔注射PILO 15 min～30 min后均出现咀嚼、流涎、节律点头等动作,之后出现单侧前肢抽搐、阵挛、直立到双侧前肢抽搐、阵挛、身体立起,最后出现强直-阵挛全面发作,后跌倒,SE发作程度达Ⅳ级～Ⅴ级,Pin组较SE组发作程度轻,多在Ⅲ级～Ⅳ级,Gli组与SE组程度基本一致。

2.2 HE染色结果 N组神经元基本紧密排列,胞核为卵圆形、圆形,染色质分布均匀、胞浆透明,核仁清晰;SE组、Gli组细胞排列紊乱,胞浆红染、嗜酸性,胞体缩小,核固缩;Pin组细胞尚排列整齐,形态尚正常,偶有嗜酸性染色细胞。

2.3 TUNEL阳性细胞检测 观察大鼠海马CA1及CA3区,N组少量TUNEL阳性细胞,SE组、Pin组、Gli组均在12 h出现TUNEL阳性细胞,24 h逐渐增多,72 h达峰值,持续至5 d。同时间点比较,SE组、Pin组、Gli组较N组明显增多(P<0.05);Pin组较SE组和Gli组明显减少(P<0.05);SE组与Gli组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组TUNEL阳性细胞数(±s)

表1 各组TUNEL阳性细胞数(±s)

组别12 h24 h72 h5 d N组4.33±0.544.28±0.534.20±0.704.11±0.55 SE组19.20±0.521)39.40±0.941)66.73±1.561)61.27±1.721)Pin组 9.58±0.881)2)3)20.80±1.661)2)3)31.87±0.991)2)3)28.22±0.881)2)3)Gli组19.04±0.701)38.97±1.201)65.67±1.141)60.78±1.141)与N组同时间点比较,1)P<0.05;与SE组同时间点比较,2)P<0.05;与Gli组同时间点比较,3)P<0.05。

2.4 Bcl-2检测 SE组大鼠海马CA 1及CA 3区Bcl-2表达较N组有明显升高(P<0.05);SE组、Pin组、Gli组均在12 h时Bcl-2表达到达高峰,24 h下降,72 h持续减低至5 d。同时间点比较,SE组、Pin组、Gli组较N组均明显增多(P<0.05);Pin组较SE组、Gli组均明显增高(P<0.05);SE组与Gli组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组Bcl-2阳性细胞数(±s)

表2 各组Bcl-2阳性细胞数(±s)

组别12 h24 h72 h5 d N组9.91±0.87 9.99±0.96 10.00±0.95 10.25±0.78 SE组36.84±1.211)30.87±1.331)18.95±0.881)14.30±0.861)Pin组 48.34±0.881)2)3)40.62±1.331)2)3)35.12±1.341)2)3)21.10±1.431)2)3)Gli组36.02±1.151)29.89±0.951)18.76±0.491)14.29±0.701)与N组同时间点比较,1)P<0.05;与SE组同时间点比较,2)P<0.05;与Gli组同时间点比较,3)P<0.05。

2.5 Caspase-3阳性细胞检测 观察大鼠海马CA1及CA3区,N组Caspase-3少量表达;SE组、Pin组、Gli组均在12 h可见Caspase-3表达,24 h达高峰, 72 h逐渐下降持续至5 d。同时间点比较,SE组、Pin组、Gli组较N组均明显增多(P<0.05);Pin组较SE组、Gli组均明显减低(P<0.05);SE组与Gli组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组Caspase-3阳性细胞数(±s)

表3 各组Caspase-3阳性细胞数(±s)

组别12 h24 h72 h5 d N组2.21±0.21 2.46±0.30 2.41±0.36 2.35±0.29 SE组19.63±1.021)35.64±1.201)29.78±1.241)26.55±1.221)Pin组 8.36±0.741)2)3)22.12±0.521)2)3)17.20±0.801)2)3)13.93±1.301)2)3)Gli组18.58±0.961)34.63±0.581)29.48±1.081)25.86±1.021)与N组同时间点比较,1)P<0.05;与SE组同时间点比较,2)P<0.05;与Gli组同时间点比较,3)P<0.05。

3 讨 论

研究发现,持续癫痫发作或SE可引起脑损伤,凋亡在这种脑损伤及神经元丢失中起重要作用[3,4],它使神经元内多种与凋亡有关的基因或蛋白酶激活。其中,凋亡抑制基因Bcl-2属于Bcl-2基因家族,Jerry等[5]发现Bcl-2可抑制线粒体膜电位降低、细胞色素C(Cyt-C)和凋亡诱导因子的释放及Caspase的激活,最终阻止细胞凋亡。另外,Caspase(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)家族是一类直接引起凋亡细胞解体的蛋白酶系统,其活化是凋亡执行阶段的重要环节。该家族成员Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶,处于凋亡级联反应的核心位置[6]。KATP是一个异源八聚体蛋白复合物(SUR/Kir6.X)4,由4个内向整流K+通道(Kir)亚基和4个磺脲类受体(SUR)蛋白调节亚基构成[7]。根据分布位置差异,分线粒体KATP(mitochondria KATP,mitoKATP)和细胞膜KATP(surface KATP,sKATP)。目前发现KATP广泛分布于脑内,在黑质、海马、大脑皮质及纹状体最多,其次是小脑、下丘脑。KATP既能被KATP开放剂激活,又能被磺酰脲复合物抑制。近年来认为KATP开放剂是一类新型脑保护药物,而本实验的吡那地尔是sKATP开放剂,格列吡嗪是磺酰脲类药物,为KATP拮抗剂。研究发现吡那地尔对心肌及大鼠大脑的缺血-再灌注损伤具有保护作用,它对癫痫引起脑损伤的保护作用,多数认为其机制是特异性激活突触前、后膜KATP,使胞内K+外流,前膜超极化,对抗电压依赖性Ca2+通道引起胞外Ca2+内流,阻止谷氨酸等兴奋性氨基酸释放[8];使突触后对谷氨酸敏感的神经元发生超极化,抑制谷氨酸释放过度而阻断突触后兴奋[9]。另有发现,还可阻止c-fos、热休克蛋白等跟凋亡有关基因的表达,减少神经元凋亡[10]。

本实验结果显示,与SE组、Gli组比较,Pin组使有抑制凋亡的Bcl-2明显增高,使升高的TUNEL、Caspase-3明显降低,表明吡那地尔对SE所致神经元损伤有一定保护作用,吡那地尔此作用可被格列吡嗪阻断,以上结果为临床诊治癫痫提供了理论依据。

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R742.1R259

:Adoi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.02.020

:1672-1349(2015)02-0190-03

2014-07-19)

(本文编辑郭怀印)

1.山西医科大学2011级神经病学硕士研究生(太原030001);2.山西医科大学第二医院

郑辑英,E-mail:281156157@qq.com