益气复脉合剂抗心律失常作用机制研究

李昊娲,武 乾,石晓璐,孙明杰,林 谦

·心律失常专题·

益气复脉合剂抗心律失常作用机制研究

李昊娲1,武 乾2,石晓璐2,孙明杰2,林 谦3

目的利用膜片钳技术阐述益气复脉合剂抗心律失常作用机制。方法采用胶原酶法急性分离大鼠左心室肌细胞,利用膜片钳技术,记录心室肌细胞动作电位。结果异丙肾上腺素(Iso)灌流前,中药组动作电位时程(APD)、APD50、APD90较空白对照组明显延长(P<0.05);Iso灌流后,空白对照组与中药组APD较灌流前显著延长(P<0.05或P<0.01),空白对照组APD50、APD90较灌流前亦显著延长(P<0.01);给Iso后,中药组APD、APD50、APD90较空白对照组显著缩短(P<0.01)。结论益气复脉合剂可以缩短Iso引起的APD的延长,可能与抑制平台期Ca2+电流和复极后期K+电流有关。

心律失常;益气复脉合剂;动作电位;膜片钳;异丙肾上腺素

心肌细胞的工作基础取决于心肌细胞膜的跨膜离子流,多种跨膜离子流的复杂变化产生心肌细胞的动作电位和静息电位,即动作电位和静息电位是多种离子通道综合作用的结果[1,2]。既往研究中发现益气复脉合剂具有抗室性心律失常作用[3]。中药益气复脉合剂在整体实验研究中已显示其抗心律失常作用,因此本实验就其抗心律失常作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠,体重200 g±20 g,购自北京华康生物科技股份有限公司,许可证编号:SCXK(京)2009-0007。

1.1.2 实验仪器与药物 渗透压仪Fiske 210(美国ADVANCE公司);DMI-UniversalPuller拉制仪;膜片钳放大器EPC 10(美国HEKA公司);微操MP-225 (美国SUTTER INSTRUMENT COMPANY);显微镜IX71(日本OLYMPUS公司);微电极B15014F(武汉微探科学仪器有限公司);pH剂PB-21(德国Sartorius公司);纯水机Elix、抽滤泵及滤膜(美国MIILIPORE公司);恒温水浴锅(美国Poly Science公司);BT100-2J蠕动泵。

益气复脉合剂(党参、黄连、半夏、鬼箭羽、川芎、丹参、赤芍、白芍、炙甘草、酸枣仁和远志),药物终浓度4.13 g/mL。异丙肾上腺素、二甲基亚砜(DMSO)和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司;Collagenase type 2购自Washington公司,其余试剂药物购自Alfa公司。

1.1.3 主要溶液配制 无钙台氏液(Tyrode solution):NaCl 140.0 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,HEPEs 10.0 mmol/L,D-Glucose 10.0 mmol/L, NaOH调至pH 7.4;有钙台式液:在无钙台式液基础上加1.8 mmol/L CaCl2;KB液:KOH 80.0 mmol/L,KCl40.0 mmol/L,KH2PO425.0 mmol/L,MgSO43.0 mmol/L,LGlutamic50.0mmol/L,Taurine20.0mmol/L,EGTA 1.0 mmol/L,D-Glucose 10.0 mmol/L,KOH调节至pH 7.2;消化液:含60%Collagenase type 2+20%BSA+50 μmol/L Ca2+的无钙台氏液;动作电位电极内液:NaCl 10.0 mmol/L,KCl 120.0 mmol/L,MgCl25.0 mmol/L, HEPEs 20.0 mmol/L,EGTA 5.0 mmol/L,Na2ATP 3.0 mmol/L,KOH调节至pH7.2;给药溶液:为有钙台式液+10μmol/L异丙肾上腺素(Iso);浴槽溶液:为有钙台式液。

1.2 方法 空白对照组(WT)给予蒸馏水3.48 mL/(kg·d)灌胃;中药组(CM)给予益气复脉合剂3.48 mL/(kg·d)灌胃,给药7 d,采用胶原酶法急性分离大鼠左心室肌细胞。于术前15 min腹腔注射肝素(1 000 U/kg),10%水合氯醛溶液(0.35 g/kg)麻醉,开胸,迅速取出带有一段主动脉的心脏,置于4℃台式液中清理和冲洗残余血液,并迅速挂于Langendorff装置上进行主动脉逆行灌注,在36.7℃,6 mL/min,恒速灌流。100%氧气饱和的有钙台式液灌流约3 min后切换100%氧气饱和的无钙台式液灌流5 min,然后迅速切换消化液循环灌流,并持续通以100%氧气。灌流中同步监测灌注压,当灌注压恢复到略低于初始灌流压力时,终止消化,此时心脏颜色变浅,触之松软。用10 mL无钙台氏液灌流冲洗残余消化液,然后于KB液中剪取左心室。用眼科剪沿心室中部横轴剪开心脏,置入KB液中,撕碎,以吸管小心吹打,200目筛网过滤,500 r/min离心约30 s。弃去上清液,更换KB液一次,间隔6 min再次更换KB液,KB液中保存。

1.3 膜片钳实验

1.3.1 电极制备 选用内径1.05 mm,外径1.5 mm,壁厚0.45 mm的软质玻璃毛细管,置于微管电极拉制仪上,经三步拉制,剖光而成。充灌电极液后电极阻抗为2 MΩ～6 MΩ。

1.3.2 全细胞膜片钳电流记录 采用全细胞电流技术记录模式C-CLAMP。细胞浴槽保持恒速灌流。

1.3.3 高阻抗封接 实验前先将存放于高钾KB液中的细胞逐步复钙,分别用0.6 mmol/L,1.2 mmol/L,1.8 mmol/L含Ca2+台式液梯度复钙,间隔6 min。静置半小时后可用于细胞动作电位的测量。取几滴细胞悬液加入细胞池(约1 mL),平放在连有微操纵仪的倒置显微镜上,静置10 min,待细胞充分贴壁后,用台式液灌流,流速为2 mL/min。玻璃电极内充灌电极内液,电阻为2 MΩ～6 MΩ。选取杆状、横纹清晰、无自主收缩的心室肌细胞进行实验。电极降入细胞外液前对电极给予正压,以防止入液后电极尖端被杂质沾染。电极入液后,点击入液补偿,补偿记录电极与参考电极之间的电位差。调节微操使电极尖端逐渐向所选定的细胞靠近。当电极尖端接触到细胞膜时,施以轻微的负压,待回路电阻值迅速升至GΩ水平,表明电极与细胞膜之间的高电阻封接(gigaseal)已经形成。

1.3.4 全细胞模式 高阻抗(>1 GΩ)封接形成后,补偿电极电容。然后负压轻吸细胞膜并逐渐加力,直至可见原为一条直线的电流图突然出现较大的细胞电容电流,这时便形成了全细胞模式,破膜后电阻大于100 MΩ。予细胞电容补偿,使图形尽量平直。

1.3.5 刺激参数的设置 本实验记录的是大鼠心室肌细胞的动作电位(action potential,AP)。刺激模式为脉宽5 ms,电流900 pA。

1.3.6 检测指标 用Patch Clamp记录动作电位,当在台式液中记录到动作电位后,稳定10 min,转换为加有10μmol/L异丙肾上腺素的灌流液,灌流30 min。记录加Iso前后的静息电位(resting potential,RP)、动作电位幅度(action potential amplitude,APA)、超射(overshoot,OS)、动作电位最大除极速率(maximum, Vmax)、动作电位时程(action potential duration, APD)、动作电位复极至25%、50%、90%的时间(action potential duration at 25%、50%、90%)。

1.4 统计学处理 用Fit Clamp、Origin 8.0、Excel 2007、SPSS 17.0处理并统计分析实验数据,实验数据以均数±标准差±s)表示,组间比较采用t检验(t-test),以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 分离后心室肌细胞镜下形态(见图1)

图1 40×镜下心室肌细胞形态

2.2 两组RP、OS、APA及Vmax比较 Iso灌流前后两组组间及组内比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)。详见表1。

表1 心室肌细胞静息电位、超射、幅度及最大上升率比较±s)

表1 心室肌细胞静息电位、超射、幅度及最大上升率比较±s)

时间组别_______n______________RP(mV)OS(mV)APA(mV)Vmax(V/s)灌流前WT10-67.18±0.3648.90±2.16113.70±4.19111.55±7.20 CM10-67.33±0.2347.03±5.59113.60±8.17117.32±8.61灌流后WT10-67.69±1.1348.40±10.33112.01±8.86113.64±10.59 _______________CM________10__________-67.52±0.4_______________________________________________________________________________________ 7 47.55±4.00113.94±5.76112.26±7.55

2.3 两组动作电位时程比较(见表2及图2) Iso灌流前,中药组APD、APD50、APD90较空白对照组明显延长(P<0.05);Iso灌流后,空白对照组与中药组APD较灌流前显著延长(P<0.05或P<0.01),且空白对照组APD50、APD90亦显著延长(P<0.01);Iso灌流后,中药组APD、APD50、APD90较空白对照组显著缩短(P<0.01)。

表2 心室肌细胞动作电位时程比较表(±s)

表2 心室肌细胞动作电位时程比较表(±s)

时间组别n APDAPD25灌流前WT1072.83±7.49 6.63±1.1117 CM1077.64±5.981)6.23±2.2420灌流后WT10116.15±10.284)6.51±1.6030 CM1083.835.132)3)6.543.0522 APD50APD90 .54±1.11 50.78±3.06 .15±2.451)55.07±4.861).99±2.894)82.43±5.824)± ± .14±2.322)59.90±8.562)与WT比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与同组灌流前比较,3)P<0.05,4)P<0.01。

图2 心室肌细胞动作电位

3 讨 论

APA可以反映Na+内流的总量,是钠离子通道功能的表现[4]。本实验结果显示,异丙肾上腺素干预前后,益气复脉合剂组和空白对照组的APA及Vmax无差异,提示其作用机制并未显著体现在Na+通道上。

异丙肾上腺素干预前,中药组APD、APD50、APD90较空白对照组明显延长(P<0.05)。心室肌APD的延长主要和Ca2+内流以及K+外流有关,这两种电流是心室肌复极2期的主要电流,推测APD、APD50、APD90的延长可能是对Ca2+内流或K+外流发挥了抑制作用[5]。APD90反映的是心室肌细胞3期复极化时程,这一过程主要是外向K+离子流的激活。适度延长APD,从而可以延长心室肌细胞的有效不应期,能够有助于折返性心动过速的防治。

异丙肾上腺素干预后,空白对照组与中药组APD均显著延长(P<0.05或P<0.01),异丙肾上腺素与β受体结合后,通过G蛋白激活腺苷酸环化酶,使细胞内环磷酸腺苷(cAMP)升高,通过蛋白激酶A引起钙通道蛋白的磷酸化,对细胞膜上的钙、钾等离子通道蛋白进行化学修饰,导致L型钙通道构型改变,使功能性钙通道数目增加,使细胞膜上有功能的通道数量增加或通道开放几率增加或单通道电导增高,从而使相应的离子流(ICaL、IK)增大[6,7]。钙窗电流增加,产生EAD和DAD[8,9],延长了动作电位时程并提高了平台期电位水平。而异丙肾干预后,中药组较空白对照组的APD、APD50、APD90显著缩短(P<0.01),推断中药益气复脉合剂可能是通过抑制Ca2+和K+电流而起到抗心律失常作用。

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Study on Mechanisms with Ant i-arrhythmic Effects of Yiqi Fumai Mixture

Li Haowa,Wu Qian,Shi Xiaolu,Sun Mingjie,Lin Qian
Beijing Anzhen Hospital,Capital Medical University,Beijing 100029,China Corresponding Author:Lin Qian(Dongfang Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078,China)

ObjectiveTo investigate the ant i-arrhythmic mechanisms with Yiqi Fumai mixture(YFM)by the patc h-clamp technique.MethodsUsing the collagenase method in acutely isolated rat left ventricular myocytes,and using patch clamp techique,to record the action potential of ventricular myocytes.ResultsBefore isoprenaline(Iso)perfusion,compared with the control group,the Ch-i nese medicine(CM)group could significantly extend action potential duration(APD),APD50 and APD90(P<0.05).After Iso perfusion,the control group and the CM group could significantly extend APD(P<0.05 orP<0.01),and the control group also could significantly extend APD50 and APD90(P<0.01).After Iso perfusion,compared with the control group,the CM group could signif-i cantly shortening APD,APD50 and APD90(P<0.01).ConclusionIt suggests that YFM can against the prolongation of APD caused by Iso,maybe related to the inhibiton of the late plateau Ca2+current and repolarization K+current.

arrhythmia;Yiqi Fumai mixture;action potential;patch clamp;isoprenaline

R541.7R289.5

:A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.02.002

:1672-1349(2015)02-0132-03

2014-12-26)

(本文编辑郭怀印)

1.北京安贞医院(北京100029);2.中国中医科学院;3.北京中医药大学东方医院

林谦,E-mail:linqian62@126.com