阳极氧化法改善钛表面的生物活性和生物相容性

闵阳，李宝娥，李莺，李海鹏，梁春永，王洪水

（1.河北工业大学材料科学与工程学院，天津 300130；2.天津医科大学口腔医院，天津 300070）

阳极氧化法改善钛表面的生物活性和生物相容性

闵阳1，李宝娥1，李莺2，李海鹏1，梁春永1，王洪水1

（1.河北工业大学材料科学与工程学院，天津 300130；2.天津医科大学口腔医院，天津 300070）

采用阳极氧化法在钛金属表面成功制备了均匀的纳米结构，生成的纳米管内径约70nm，壁厚20nm，管长200 nm．通过模拟体液浸泡实验对植入体的生物活性进行了评价，并通过体外细胞培养实验对生物相容性进行了评价．结果表明：经模拟体液浸泡4周后，阳极氧化处理后的钛表面可诱导磷灰石生成，而仅经过机械打磨的钛金属表面不能．细胞培养实验表明，阳极氧化处理后的钛相较于未处理的钛，有利于细胞在其表面粘附和增殖．基于上述研究结果可知：阳极氧化处理后的钛表面，提高了表面的粗糙度和亲水性，从而改善了钛的生物活性和生物相容性．

钛；阳极氧化；纳米管；生物活性；生物相容性

0 引言

由于具有优良的生物相容性和机械性能，钛（Ti）及其合金是临床医学最常用的牙科和骨科移植材料[1-2]．但是，钛的生物惰性常常导致钛植入物与骨组织结合不良，增加长期使用后植入物松动的风险，这在一定程度上限制了钛植入物的应用．

为了改善钛植入物的生物学性能，研究者们采用了一系列方法对其进行表面改性，例如机械法（例如：喷砂法[3]，飞秒激光刻蚀法[4]）、化学法（例如：酸蚀法[2-3]）以及覆层法（例如：羟基磷灰石[5]，硅钙石[6]）．这些方法通过在钛表面构建有利于细胞生长的结构和涂层物质，实现了生物学性能的改善．但是，迄今为止这些方法的1个不足在于，无论是化学法还是机械法都不能得到高度可控的表面结构．此外，一些方法还有可能形成表面残余物，对成骨细胞产生有害作用[7]．因此，在钛表面制备高度可控的表面结构以改善钛植入物的生物学性能具有重要研究意义．

阳极氧化法可在钛表面形成高度可控的纳米结构，且阳极氧化法是一种简单、经济、易操作的电化学方法，目前已在多种金属和合金上形成均匀可控的纳米结构（例如：氧化铝，钛合金）[8]．但是，这些纳米结构主要用于改良腐蚀性或耐磨性、改变金属颜色、提高结合强度等方面[9-11]．在生物医学领域的应用却很少有人报告[12]．

因此，本研究的目的就是通过阳极氧化技术在钛表面制备高度可控的纳米结构，然后探究纳米结构表面对生物学性能（生物活性和生物相容性）的影响；通过考察材料在模拟体液中诱导磷灰石生成的能力对钛植入物的生物活性进行评估；通过测定体外细胞在材料表面的黏附和增殖来评估材料的生物相容性．

1 材料与方法

1.1 制备样品

实验所用钛片为市售TA1钛板，线切割为10mm×10mm×1mm后，用#1000SiC砂纸打磨处理，然后分别在丙酮、乙醇和去离子水中超声清洗5min，再使用直流（dc）电压源（WYK-150，中国扬州）进行阳极氧化实验．阳极氧化处理过程中，钛板作为阳极，石墨（40mm×40 mm×5mm）作为阴极，两极间距为40 mm，1 mol/L NaF溶液用作电解液，在10V电压和室温条件下阳极化反应1h．阳极氧化处理后，对样品进行清洗、干燥、进行后续实验测试．为了进行比较，未经阳极氧化处理的打磨钛板用作对照组样品．

1.2 表面表征

利用场发射扫描电镜（SEM，HITACHI S-4800）观察所得样品的表面形貌．通过X射线衍射（XRD）分析晶体结构．利用原子力显微镜（AFM，Agilent5500）测定表面粗糙度，根据室温下去离子水与样品表面的接触角对亲水性进行评估．为了避免重力和蒸发引起形状改变，接触角测量中选择水滴体积为2L．利用显微镜上的数码摄像头（1280×960像素）得到水滴的图像，然后采用图像分析软件处理图像．

1.3 生物活性评估

将阳极氧化处理前后的样品浸泡在37℃的模拟体液（SBF）中静置，考察类骨磷灰石在其表面的生成情况．SBF中的离子浓度几乎等于人体血浆中的离子浓度．SBF的制备方法是，在36.5℃将分析纯的NaCl、NaHCO3、KCl、KH2PO43H2O、MgCl26H2O、CaCl2和Na2SO4依次溶解在去离子水中，通过45mmol/L三甲基氨基甲烷（(CH2OH)3C(NH2)）和1mol/LHCl将试样pH值调为7.4．样品在SBF中静置4周后，利用SEM和XRD研究样品表面的磷灰石生成情况．

1.4 生物相容性的评估

进行细胞培养实验之前，将样品在121℃下通过高压蒸汽灭菌30min．将天津医科大学提供的MC3T3-E1小鼠前成骨细胞接种到样品表面，接种密度为1×104个/cm2．细胞培养液为含有10%牛胎血清（Hyclone，Logan，USA）和3%青霉素/链霉素的DMEM培养液（GibcoBRL，USA）．将细胞置于37℃的CO2培养箱内，培养1d、4d和7d后，分别用MTT（3-4,5-二甲基噻唑-2-yl-2,5-二苯基四唑溴化物，Sigma）比色度检测法对样品表面的细胞增殖进行评估[13]．为了观察样品表面的细胞附着情况，将样品表面附着的细胞在2.5%的戊二醛溶液中固定4h，然后用磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）冲洗2次、梯度乙醇脱水、临界点干燥，在表面喷金后，用SEM观察细胞形态．

1.5 统计学分析

通过一维方差分析不同组实验变量间有无显著差异．每组变量至少包含3个有效值，显著差异水平设定为p=0.05．

2 实验结果

在NaF溶液中阳极氧化处理后，钛表面形态发生显著变化，如图1，图2所示．

相比于打磨钛的光滑表面，阳极氧化处理使得钛表面形成了尺寸均匀的纳米管阵列．纳米管内径约为70nm，管壁厚度约为20nm，管长约为200nm．由于表面粗糙度和亲水性是关系到材料生物学性能的两大重要因素，样品的表面粗糙度和亲水性分别用AFM和接触角仪进行了测定，实验结果如图3～图6所示．

AFM法测得阳极氧化钛表面的粗糙度为200 nm，明显大于打磨钛片的粗糙度数值（约为40 nm）．且阳极氧化处理可使得去离子水在其表面的接触角从大约90°下降至大约32°，表明阳极氧化可将疏水的钛表面转变为亲水表面．

图1 打磨钛的表面形貌Fig.1 Surfacemorphologyoftheas-polishedTisamples

图2 阳极氧化处理钛的表面形貌Fig.2 SurfacemorphologyoftheanodizedTisamples

图7～图8为阳极氧化处理前后的钛表面经SBF浸泡4周后的表面形貌图．

图3 打磨钛的表面粗糙度Fig.3 Thesurfaceroughnessoftheas-polishedTisamples

图4 阳极氧化钛的表面粗糙度Fig.4 ThesurfaceroughnessoftheanodizedTisamples

图5 打磨钛的接触角Fig.5 Thehydrophilicityoftheas-polishedandTisamples

图6 阳极氧化钛的接触角Fig.6 ThehydrophilicityoftheanodizedTisamples

图7 打磨钛经SBF浸泡4周的表面形貌Fig.7 Surfacemorphologiesoftheas-polishedTi samplesafterimmersioninSBFforfourweeks

可以看出打磨的钛表面经SBF浸泡后，表面形貌并无明显改变，表明没有形成磷灰石．而阳极氧化处理后的钛表面均匀地形成了一层物质，覆盖了TiO2纳米管结构．经XRD图谱证实，这层新生成的物质为磷灰石．这些结果说明纳米管结构可诱导磷灰石在其表面生成，阳极氧化处理能够提高钛的生物活性．

在阳极氧化处理前后的钛表面，细胞增殖情况如图9所示．

可以看出，培养1 d后，2种样品表面的细胞数量没有统计学差异（p＞0.05）．随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多．到第4d时，阳极氧化处理后的钛表面，其细胞数量明显高于对照打磨钛片（p＜0.05）．到第7 d时，阳极氧化处理后的钛表面细胞数量大约为对照打磨钛表面上的2倍．从而揭示出，钛表面经阳极氧化处理后能够加速细胞增殖．细胞在阳极氧化处理前后的钛表面培养7d后，其形貌如图10～图11所示．

可见，对照打磨钛表面的细胞形态，阳极氧化处理有利于细胞在其表面的铺展、增殖．

3 讨论

许多研究者都指出材料表面结构会影响细胞的反应，也会影响在植入物与宿主组织之间起连接作用的组织生长．研究表明，纳米结构表面的尺度接近于天然骨结构，将给细胞附着、增殖能力以及造骨能力带来有利影响，更好地实现骨整合．此外，纳米结构提供的高比表面积，特别是纳米结构之间的空隙，能为骨细胞结合和体液渗透创造有利条件，有效改善骨与植入物的结合．

图8 阳极氧化处理钛经SBF浸泡4周的表面形貌Fig.8 SurfacemorphologiesofanodizedTi samplesafterimmersioninSBFforfourweeks

图9 打磨钛、阳极氧化处理钛经MTT法测试在不同时间下成骨细胞的增殖情况Fig.9 MTTassayrepresentingtheMC3T3-E1cellproliferationontheas-polishedandanodizedTisurfaces

图10 打磨钛表面的细胞形貌Fig.10 Cellproliferationontheas-polishedTisamples

图11 阳极氧化钛表面的细胞形貌Fig.11 CellproliferationontheanodizedTisamples

此外，许多研究均表明材料表面的粗糙度和亲水性也会影响细胞的行为[15]．在本研究工作中，与对照打磨钛表面相比，阳极氧化处理生成的无定形TiO2纳米管阵列粗糙度高、亲水性好．亲水性得到提高的原因可能是材料表面形成了大量OH基团[16]．已有研究者通过表面粗化处理提高钛表面亲水性，并证实该表面能够增大细胞附着蛋白质的吸附量[17]．此外，亲水性基质表面也已被证实可促进成骨细胞的附着、生长和基因表达．本研究中，通过阳极氧化处理提高钛表面的粗糙度和亲水性，进而促进了细胞在表面的黏附、增殖，这与文献中报道的一致，亲水表面含有丰富的OH基团（Ti-OH），它与模拟体液中的氢氧根离子反应使得钛表面形成大量的负电荷（Ti-O）．这些负电荷能够吸引SBF溶液中带正电的钙离子．进而由带正电的钙离子将带负电的HPO24离子吸引到钛表面，形成一种由磷酸氢钙组成的含水前驱体．之后，它们依靠消耗周围体液中的钙离子和磷酸盐离子自发生长，最后晶化成磷灰石结构．

在本研究中，证明了阳极氧化处理能够提高钛表面的粗糙度和亲水性，从而改善了钛的生物活性和生物相容性．但是，今后还需进一步优化纳米管的尺寸，获得最佳的生物学性能．

4 结论

本文采用阳极氧化法在钛表面制得尺寸均匀的纳米管阵列结构．纳米管内径约为70nm，管壁厚度约为20 nm，管长约为200nm．纳米管的形成提高了钛表面粗糙度和亲水性，有利于磷灰石生成，并促使细胞在其表面黏附、增殖，表现出优良的生物活性和生物相容性．

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[责任编辑 田丰]

Improvementofsurfacebioactivityandbiocompatibility ontitaniumbyanodicoxidation

MINYang1，LIBaoe1，LIYing2，LIHaipeng1，LIANGChunyong1，WANGHongshui1

(1.SchoolofMaterialsScienceandEngineering,HebeiUniversityofTechnology,Tianjin300130,China;2.StomatologicalHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Anodicoxidationwasappliedtoproduceahomogeneousanduniformarrayofnanotubesonthesurfaceoftitanium(Ti)implants.Theinnerdiameterofthenanotubes wasabout70nm,thewallthicknesswasaround20nm,andthedepthwasabout200nm.ThebioactivityoftheTiimplantswasevaluatedbysimulatedbodyfluidsoakingtest.The biocompatibilitywasinvestigatedbyvitrocellculturetest.Theresultsshowedthatbone-likeapatitewasformedontheanodizedTisurface,butnotontheas-polishedTisurfaceafter immersioninsimulatedbodyfluidforfourweeks.CellsculturedontheanodizedTisurfaceshowedenhancedcelladhesionandproliferation,alsopresentedanup-regulatedgeneexpressionofosteogenicmarkersOPNandOCN,comparedtothoseculturedontheas-polishedTisurface.Basedontheseresults,itcanbeconcludedthatanodicoxidationimproved thebioactivityandbiocompatibilityofTisurface,whichwasattributedtotheformationofnanostructuredsurfaceaswellasthenanosurfaceinducinghighsurfaceroughnessandhydrophilicity.

Titanium;anodicoxidation;nanotube;ioactivity;biocompatibility

R318.08

A

1007-2373(2015)06-0063-05

10.14081/j.cnki.hgdxb.2015.06.012

2015-03-17

国家自然科学基金（51171058，51201056）；中国科学院无机涂层材料重点实验室开放基金（KLICM-2012-02）；河北省自然科学基金（E2013202021，E2013202022）；河北省科技计划项目（13211027）；天津市科技特派员项目（14JCTPJC00496）

闵阳（1989-），男（汉族），硕士生．通讯作者：李宝娥（1979-），女（汉族），副教授，libaoe@hotmail.com．

数字出版日期：2015-11-18数字出版网址：http://www.cnki.net/kcms/detail/13.1208.T.20151118.1047.004.html