土壤微生物总DNA提取及其PCR优化

李 超,梁俊峰

(1.中国林业科学研究院热带林业研究所, 广东 广州 510520；2.国家林业局桉树研究开发中心，广东 湛江 524022)

土壤微生物总DNA提取及其PCR优化

李 超1,2,梁俊峰1＊

(1.中国林业科学研究院热带林业研究所, 广东 广州 510520；2.国家林业局桉树研究开发中心，广东 湛江 524022)

采用3种不同土壤微生物总DNA提取方法对广东省乐昌杨东山十二度水自然保护区的样地土壤进行比较研究，进一步通过PCR扩增，研究牛血清白蛋白(BSA)对整个PCR扩增过程的影响。结果表明：试剂盒提取法相对于其他两种提取方法更加方便有效，当土壤样品量比较大时，直接提取法是最经济有效的方法；而在土壤微生物的PCR扩增实验中，加入2 µl的BSA，可以有效地抑制腐殖酸等对后续PCR扩增的影响。

土壤微生物；DNA提取；牛血清白蛋白；PCR扩增

传统上，利用微生物形态、培养特性、生理生化特性及遗传特性作为依据对微生物进行分类和鉴定来研究微生物多样性制约因素很多，且 85% ~ 99%的环境微生物不能被分离识别[1]。近年，基于PCR技术的分子生物学方法应用于土壤微生物多样性研究已成为一种趋势，弥补了传统土壤微生物培养和鉴定方法不能真实反映待测环境的不足[2-3]。土壤理化性质十分复杂，粗提取的土壤DNA中均含有腐殖酸、酚类化合物和重金属离子等抑制性污染物，其中腐殖酸是土壤的主要成分，微量的腐殖酸即可抑制PCR扩增中的TaqDNA聚合酶以及酶切反应的限制型内切酶活性[4-6]，且腐殖酸在 DNA的提取过程中出现与 DNA共提取的现象，并和DNA紧密结合，导致其很难与DNA分离[7-8]。因此，如何减少腐殖酸的抑制作用，获得良好的PCR扩增结果成了土壤微生物多样性研究的关键。

Tebbe等[5]研究发现0.08 µg·m L-1腐殖酸足以抑制PCR扩增中极为敏感的Taq聚合酶活性，因此DNA稀释后再进行PCR扩增可降低腐殖酸等抑制物的浓度，从而显著减少其抑制作用。A l-Soud等[9]通过离子交换色谱成像系统和荧光定量 PCR仪等来鉴定和纯化人体血细胞内的 PCR扩增抑制物成分，结果表明血红蛋白和乳铁蛋白中的9种扩增促进剂中牛血清白蛋白(BSA)的效果最明显。Forbes等[10]通过内部控制实验研究抑制用于直接检测临床样本的结核分枝杆菌PCR实验的干扰物质，数据结果表明 BSA在直接检测呼吸道标本的结核分枝杆菌的PCR反应中至关重要。

国内外关于土壤微生物总DNA提取方法的研究很多，而土壤质地和成分的差异也会影响土壤微生物DNA的提取效果[11]，提取的方法也有一定的差异。本研究对广东省乐昌杨东山十二度水自然保护区样地的土壤微生物进行了比较，以期找到一种快速、简便、高效的DNA提取方法用于后续土壤微生物多样性和种群变化的研究。

1 试验地概况

杨东山十二度水省级自然保护区位于广东省韶关市乐昌东北部，该保护区正北面与湖南省接壤，自北向南跨越九峰、五山、北乡、廊田四镇和龙山林场。地理位置为 113°23′09″ ~ 113°29′32″ E，25°22′47″ ~ 25°11′06″ N，总面积11 651 hm2，光照充足、温暖湿润、雨量充沛，属于中亚热带季风气候[12]。土壤类型主要有山地红壤、山地黄壤、山地灌丛草甸土、石灰土和水稻土。地貌特征属于南岭山地，最高海拔1 726.6 m。该区年均气温18.1 ~ 19.9℃，年降水量超过1 700 ~ 1 800 mm。

2 材料与方法

2.1 样品采集

2008年9月在广东省乐昌杨东山十二度水自然保护区的样地进行土壤样品采集，样地面积50 m × 30 m，并细分为10 m × 10 m的样方，采样时尽量在相对平坦、地表植被覆盖较好的地方采集土壤样品，采用五点采样法取地表下0 ~ 15 cm土样混合均匀后装入无菌自封袋，贴上标签，带回实验室放入−20℃冰箱保存用于后续实验。样品保存时间不超过1周。

2.2 研究方法

2.2.1 土壤微生物总DNA的提取及纯化

2.2.1.1 直接提取法

参照芦晓飞等[8]的DNA提取方法稍改进。

2.2.1.2 真菌提取法

(1) 将采集的土壤样品用孔径25目的分样筛混匀筛除沙石并分装，称取样品1 ~ 3 g，置于10 m L灭菌离心管；(2) 加5 m L TENP (pH=10.0) ，混匀3 min (在摇床上摇5 m in，37℃ 250 rpm)，再12 000 rpm离心3 m in，去上清。(3) 重复3 ~ 4次或更多，直至上清液较清；(4) 加入PBS 5 m L，混匀3 ~ 5 min，12 000 rpm 离心3 min，弃上清；(5) 加入65℃预热好的4 × CTAB提取液5 m l，混匀，置于65℃水浴2 ~ 3 h，其间摇匀4 ~ 5次(4 × CTAB：1 L溶液中，1 M Tris-HCl 100 m L (pH 8.0)，NaCl 82 g，0.5 M EDTA 40 m L (pH 8.0)，CTAB 40 g，PVP 2 g)；(6) 加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀，12 000 rpm 离心15 m in，取上清；(7) 加入等体积的异丙醇沉淀，放入 4℃冰箱保存过夜；(8) 离心10 min，去上清，用70%酒精和无水乙醇3 m L各洗1次，晾干后加入30 µl ddH2O或TE。

2.2.1.3 试剂盒提取法

按照生工生物有限公司提供的 Ezup柱式土壤基因组 DNA抽提试剂盒操作步骤提取土壤总DNA。

2.2.2 PCR扩增及电泳检测

在rDNA基因中，16S rDNA和28S rDNA基因间隔序列称为(ITS)，它的长度和序列变化较大，将其扩增物进行序列分析，可用于对真菌的不同生物型、菌株、种、属进行分类鉴定。采用通用引物ITS1和 ITS4来扩增核糖体基因内转录间隔区(rDNAITS)。引物：ITS 1 (5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’)和ITS 4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3’)。PCR体系(50 µl)：ITS 12 µl，ITS 42 µl，10 × Buffer 5 µl，dNTP 5 µl，Taq酶0.8 µl，超纯水31.2 µl，模板2 µl，BSA(牛血清白蛋白) 2 µl (2.0 mg·m l-1)。土壤真菌PCR扩增程序：35 cycles，95℃5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 2 m in；72℃ 7 min。检测：1.0%琼脂糖电泳进行检测，并拍照记录。

2.2.3 扩增片段的纯化回收

选用北京百泰克生物技术有限公司的多功能DNA纯化回收试剂盒，得到的DNA溶液置于−20℃保存或者直接用于后续实验。检测：1.0%琼脂糖电泳进行检测，并拍照记录。

3 结果与分析

3.1 DNA颜色及量的比较

直接法提取的土壤总DNA量最多，颜色呈深褐色，其次为真菌提取法，颜色最淡的为试剂盒提取的DNA，结果表明直接法提取的DNA含有腐殖酸等杂质较多，但提取的DNA总量也多，试剂盒属于微量提取法，获得的DNA纯度较高，试剂盒提取更方便快捷，但费用相对较高。

3.2 电泳检测结果

用1% 琼脂糖在1 × TAE缓冲液中进行电泳检测，每条电泳道加5 µl DNA原样。由图1可知，直接法提取的A1、B1、C1、D1四个土壤样品的总DNA电泳图，条带较清晰，亮度最大，质量较好；A2、B2、C2、D2为真菌法提取样品的DNA，条带最模糊，亮度最低，但对大型真菌的总DNA的提取效果却很好；A3、B3、C3、D3为试剂盒法提取的4个土壤样品的总DNA，条带很清晰，含杂质量最少，但亮度稍微比直接法低，说明直接提取法的总DNA量最大，由于试剂盒成本昂贵，少量提取是可行的，如果土壤样品量需求比较大，最经济有效的方法为直接提取法。

3.3 PCR扩增结果

由于试剂盒提取的DNA溶液仍会含有少量的腐殖酸等物质，而微量的腐殖酸即可抑制PCR扩增中Taq聚合酶及限制性内切酶的活性，通过查阅相关文献发现牛血清白蛋白(BSA)广泛应用于酶反应及PCR反应系统中，用来减少内源抑制物的干扰作用[13]，BSA的加入，能够减小活性污泥微生物样品中残留腐殖酸和棕黄酸等杂质在 PCR扩增中的抑制作用[14]。不同研究采用的 BSA最适浓度不同，本研究采用的BSA浓度为2.0 mg·m l-1。通过实验还发现，对于本研究的土壤及腐殖质层样品进行PCR的过程中，设计从50 ~ 60℃的退火温度，扩增结果的变化不是太大，而以55℃效果最佳。本实验模板DNA为采用试剂盒提取法提取的总DNA稀释5倍后取2 µl作为扩增模板。

由图2可知，左边4个条带A1、B1、C1、D1为PCR反应体系中未加BSA的4个样品PCR扩增结果，条带若隐若现，很难看到；中间4个条带A2、B2、C2、D2为50 µl体系中加入2 µl BSA的扩增结果，条带清晰；右边4个条带A3、B3、C3、D3为50 µl体系中加入5 µl BSA的扩增结果，有条带，但不如2 µl BSA的扩增结果清晰。因此，在土壤微生物的PCR扩增实验，加入适量的BSA，可有效地抑制腐殖酸等的污染，对实验结果产生很好的优化作用，且本次实验加入BSA的量为2 µl效果最好，因此添加 BSA是一种既经济又有效的辅助措施。

4 结论与讨论

研究结果表明，3种DNA提取方法均可提取本研究样地土壤基因组总DNA，但每种方法获得的结果存在一定的差异，试剂盒提取法快速便捷，但实验成本相对较高，适用于在较短时间内获得直接用于PCR扩增的较高纯度的DNA，不适合进行样品量需求较大的研究。因此针对不同土壤类型，应该选择合适简便有效的DNA提取方法。

实验过程中还发现DNA总浓度越高，PCR扩增的效果越不理想，而把DNA浓度稀释后在电泳中已检测不到条带，也能有较理想的 PCR扩增结果，说明对粗提取的DNA进行稀释也是减少杂质影响的有效途径。鲍立新等[14]以有机废水厌氧生物处理系统中的活性污泥为样本，研究了BSA对PCR扩增的影响。结果表明，通过条件优化，提高了图谱的分辨率和可读性，添加BSA前后形成的SSCP图谱条带的多样性基本不变，但加BSA后的条带更加清晰，可读性更强。本实验也证明了在森林土壤微生物群落多样性研究的样品PCR扩增时，添加适量 BSA有助于降低样品中残留腐殖酸等的抑制作用，使PCR结果更加显著，是一种可尝试的优化手段。当然影响PCR扩增的因素还有很多，试剂的浓度、反应的条件及实验步骤的优化均有可能影响到实验的最终结果。

关于如何快速有效地提取土壤中的总DNA，并适合后续的PCR扩增反应的研究很多[11,15-17]。而根据不同的土壤类型及森林类型，方法各异。近年，基于 PCR技术的分子生物学方法已大量地应用于土壤微生物多样性研究，因此选择合适的DNA提取方法，把 PCR反应体系中各因子优化到最佳浓度，并把BSA合理地运用到土壤微生物PCR反应体系中成为了整个土壤微生物实验的关键。

[1] Yu Z,Morrison M.Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of m icrobial communities by PCR- denaturing gradient gel electrophoresis[J].Applied and Environmental M icrobiology, 2004,70(8):4800‒4806.

[2] 李丹,王秋玉.变性梯度凝胶电泳及其在土壤微生物生态学中的应用[J].中国农学通报,2011,7(3):6‒9.

[3] 刘国华,叶正芳,吴为中.土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养[J].生态学报,2012,32(14):4421‒4433.

[4] 徐晓宇,闵航,刘和,等.土壤微生物总 DNA提取方法的比较[J].农业生物技术学报,2005,13(3):377‒381.

[5] Tebbe C C,Vahjen W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast[J].Applied and Environmental M icrobiology,1993, 59(8):2657‒2665.

[6] Steffan R J,Atlas R M.DNA amplification to enhance detection of genetically engineered bacteria in environmental samples[J].Applied and Environmental M icrobiology,1988,54(9):2185‒2191.

[7] 芦晓飞.西藏高寒草甸土壤微生物及功能基因多样性研究[D].北京:中国农业科学院,2009.

[8] 芦晓飞,赵志祥,谢丙炎,等.西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建[J].应用与环境生物学报,2009,15(6):824‒829.

[9] A l-Soud W A,Radstrom P.Purification and characterization of PCR inhibitory components in blood cells[J]. Journal of clinical m icrobiology,2001,39(2):485‒493.

[10] Forbes B A, Hicks K E. Substances interfering with direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens by PCR: effects of bovine serum albumin[J]. Journal of clinical m icrobiology,1996,34(9):2125‒2128.

[11] 陈旭玉,周亚奎,余贤美,等.一种直接用于PCR的土壤微生物DNA提取方法[J].中国农学通报,2008,24(4):33‒36.

[12] 赵霞,沈孝清,黄世能,等.冰雪灾害对杨东山十二度水自然保护区木本植物机械损伤的初步调查[J].林业科学,2008,44(11):164‒167.

[13] 边才苗,李钧敏,金则,等.牛血清白蛋白在植物RAPD分析中的作用[J].遗传,2002,24(3):279‒282.

[14] 鲍立新,李建政,赵焱,等.厌氧活性污泥微生物群落的SSCP分析条件优化[J].科技导报,2008,26(2):28‒32.

[15] 金海林,金东淳,李颖,等.土壤微生物3种DNA提取方法的比较[J].延边大学农学学报,2010,32(1): 59‒61,68.

[16] 胡磊,杨广,尤民生,等.茶园土壤微生物总 DNA不同提取方法的比较[J].基因组学与应用生物学,2010,29(2): 361‒368.

[17] 孙海明,朱梅,郭宇南,等.不同土壤微生物DNA提取方法比较[J].北华大学学报:自然科学版,2011,12(5):550‒ 552.

Comparison of Extraction M ethods For Soil M icrobe DNA and Effectiveness of BSA for PCR Amp lification

LI Chao1,2, LIANG Jun-feng1
(1. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China; 2. China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, Guangdong, China)

The extracting efficiency of three methods for soil DNA extraction and isolating of m icrobial soil DNA from sites in Yangdongshan Shierdushui Nature Reserve was examined. A lso, the effect of bovine serum albumin (BSA) on PCR amplification of the DNA obtained was studied. The results showed that the DNA Extraction Kit method was the most simple and effective method. However, for large numbers of soil samples, the most economical method proved to be ‘the direct method’. It was found that 2 µl BSA could inhibit the deleterious effects of humic acid on PCR amplification of soil m icrobe DNA.

soil m icrobes; DNA extraction; BSA; PCR amplification.

S154.3

A

2015-04-27

中国林业科学研究院基本科研业务费专项( CAFYBB2014MA003)和广东省林业科技创新重点项目( 2014KJCX019-01)

李超(1987— )，女，硕士，助理工程师，主要从事土壤微生物及遗传多样性研究

＊梁俊峰为通讯作者