基质分散固相萃取-超高效液相色谱法检测辣椒制品中苏丹红染料

曾宪冬 柳洁 曾灼祥 孟楠

摘 要：本文结合基质分散固相萃取和超高效液相色谱技术，建立一种快速、简单的测定辣椒制品苏丹红类染料残留的分析方法。该方法简单、快速、准确，适用于辣椒制品中苏丹红类染料的测定。4种苏丹红在0.05～2.0μg/mL的范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，检出限为0.01mg/kg，加标回收率在83.7%～101.2%之间，相对标准偏差在1.16%～7.58%之间。

关键词：基质分散固相萃取 超高效液相色谱 苏丹红染料 辣椒制品

苏丹红是一类广泛应用于油彩、蜡、地板蜡、和香皂等工业中的人工合成化工染色剂，长期摄入会在体内累积而造成肌体损伤或基因突变而致癌[1]。中国和欧盟均已禁止其用于食品生产中，但仍有不法厂商在辣椒等食品中非法添加使用。由于辣椒制品基质复杂，需要对样品进行萃取净化，常用的前处理方法有固相萃取法、液-液萃取法、分子印迹固相萃取法等，然而这些预处理方法存在耗时、有机溶剂用量大和操作繁琐等问题。现行国标方法中，前处理步骤繁琐，且难以准确控制氧化铝的活化程度造成方法重现性较差[2]。基质分散固相萃取是近年发展起来的一种新型样品预处理技术，目前在食品安全监测中已有较多应用[3]。本研究利用MSPD进行样品预处理，结合超高效液相色谱法检测，建立了一种简单、快速、准确检测辣椒制品中4种苏丹红的方法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪。

苏丹红I、II、III、IV标准品（含量均>95%，德国Dr.Enrenstorfer公司）；甲醇、乙腈、正己烷和丙酮（HPLC级，美国Fisher公司）；弗罗里硅土（60-100目，阿拉丁试剂）；中性氧化铝（100-200目，阿拉丁试剂）；其余试剂均为分析纯，试验用水超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：B E H C 1 8柱，2.1×50mm，1.7μm；柱温：30℃；进样量：2μL；检测波长：苏丹红I：475nm，苏丹红II、III、IV：520nm；流动相：乙腈—0. 1%甲酸水溶液，梯度洗脱。1.3 测定方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取苏丹红I、II、III、IV各10. 0mg于100mL容量瓶中，加乙腈溶解后定容至刻度，配成100mg/mL的储备液。临用前用乙腈配成0，0.02，0.05，0.1，0.5，1.2μg/mL的标准系列。

1.3.2 样品前处理

准确称取0.50g样品于玻璃研钵中，加入0.50g无水硫酸钠、0.50g弗罗里硅土（或其他吸附剂）、0.50g石英砂。将上述样品在研钵中研磨3～5min，直至获得均匀干燥的混合物。将研磨好的样品装于6ml的空固相萃取柱中，用玻璃棒轻轻按压平整。填装好的样品，先加入5mL正己烷除掉脂肪等杂质，然后加入5mL乙腈进行洗脱，弃去最初的1mL洗脱液后进行收集，收集的洗脱液在70℃下用氮吹至干，加入0.5mL乙腈溶解后作为样品分析液。

1.3.3 样品测定

取标准系列应用溶液和样品分析液各2.0μL上超高效液相色谱仪分析，以保留时间定性，峰面积外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 基质分散固相萃取条件的优化

2.1.1 吸附剂种类及用量的选择

比较了C18、PSA阴离子交换吸附剂、WCX弱阳离子交换吸附剂、中性氧化铝及弗罗里硅土5种不同类型吸附剂萃取效果。结果表明使用弗罗里硅土，可以获得较满意的回收率，其原因在于弗罗里硅土对四种苏丹红染料具有较强的吸附作用，确保在净化过程不被正己烷洗脱，同时能很好地被乙腈洗脱下来进行测定。因此，选用弗罗里硅土作为吸附剂。

吸附剂用量对吸附效果具有重要影响，对于0.5g加标浓度为0.5mg/kg的辣椒酱样品，当吸附剂用量从0.1g增加至0.5g时，回收率也随之增大，当吸附剂用量大于0.5g后，回收率趋于稳定，因此本研究中吸附剂的用量选取为0.5g，即样品量与吸附剂量为1∶1。

2.1.2 净化与洗脱溶剂的选择

辣椒制品中含有大量的油脂类物质，不但影响苏丹红在液相色谱仪上的测定，还会影响到样品提取液的浓缩，因此在洗脱之前要对样品进行净化，通过实验表明，使用5mL正己烷冲洗基质分散固相萃取柱，可以很好地去除脂肪及弱极性的干扰物。

本研究试验了丙酮、乙腈、乙腈-水（8∶2）、甲醇5种溶剂的洗脱效果，结果表明，5种溶剂均能有效地洗脱苏丹红染料，但是用丙酮作为洗脱剂的情况下，样品中的一些极性物质被丙酮洗脱下来，不能和苏丹红I的峰很好地分开，干扰其测定。考虑到液相色谱所使用的流动相，本研究选择乙腈作为洗脱溶剂。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱及流动相的选择

苏丹红类染料具有亲脂性，在反相色谱柱上具有较强的保留时间，本研究选择BEH C18 2.1×50mm，1.7μm的柱子作为分离柱，4种苏丹红染料能得到很好地分离。

苏丹红类染料的分子结构中含有的偶氮基易与邻位的羟基形成分子内氢键，具有较好的稳定性、不易解离。在流动相中加入一定量的甲酸，将有利于苏丹红分子内氢键的形成。通过实验，最终确定以乙腈和0.1%的甲酸水溶液作为流动相，梯度洗脱下，4种苏丹红峰形良好，都能与样品中的杂质得到较好地分离。

2.2.2 检测波长的选择

通过对苏丹红（Ⅰ、II、III、IV）标准溶液进行光谱扫描，确定检测波长为苏丹红Ⅰ478nm，苏丹红II、III、IV520nm。

在选定的色谱条件下，加标浓度为0.2mg/kg的辣椒油样品色谱图如图1所示，从图中可以看出4种苏丹红在3分钟内能得到很好地分离，样品基质对于测定没有干扰，在4种苏丹红全部出峰后继续运行1分钟，使得样品提取液中的类胡萝卜素完全流出，总的色谱分析时间仅需4分钟。

2.3 方法的线性范围与检出限

以苏丹红浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果表明4种苏丹红浓度在0.05～2.0μg/mL的范围内与峰面积呈良好线性关系（图2），以3倍信噪比计算，上机液中苏丹红的最低检出浓度均为0.01μg/mL。以取样量0.5g，提取液浓缩至0.5mL计，样品中苏丹红的检出限为0.01mg/kg。

2.4 回收率与精密度

以不含苏丹红的辣椒、辣椒酱、火锅底料为空白样品基质，进行低、中、高3个不同浓度（0.05、0.1、0.5 mg/kg）的加标回收实验，每一浓度水平测定6次。4种苏丹红染料的回收率为83.7%～101.2%，相对标准偏差为1.16%～7.58%，这些结果表明该方法具有良好的准确度与精密度。

3 结论

针对辣椒制品的复杂基质，本文探讨了基质分散固相萃取净化技术结合超高效液相色谱法快速检测辣椒制品的苏丹红I、II、III、IV含量，方法前处理简单方便，分析速度快，灵敏度高、具有良好的线性范围及低的检出限。为辣椒制品中违法添加苏丹红着色剂的分析提供了一种方便、快速、准确的方法。

参考文献

[1] 刘芳，秦秀荣.苏丹红及其加入食品中的危害[J].时代教育（教育教学版），2008，（3）：226-227.

[2] 中华人民共和国质量监督检验检疫总局.GB/T 19861-2005.食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法[S].北京：中国标准出版社，2005.

[3] 渠凌丽，周颖，权泰鹏等.基质分散固相萃取-高效液相色谱法快速测定奶粉中三聚氰胺[J].中国卫生检验杂志，2012，21（11）：2595-2597.