重组大肠埃希菌外膜蛋白OmpT 的载体构建和 表达条件优化及多克隆抗体制备

刘祥，俱雄，陈春琳

(陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

大肠埃希菌(Escherichia coli)广泛存在于自然环境中，按其致病机理可分为产肠毒素性、肠道侵袭性、肠道致病性、肠集聚黏附性和肠出血性5种[1]，可引起人畜共患病[2]，包括腹泻[3]、脑膜炎[4]、尿道感染[5]、食物中毒[6]等；由其导致的奶牛乳房炎发病率呈逐年上升趋势，给奶制品生产及品质带来重大影响[7–8]。大肠埃希菌外膜蛋白酶 T(outer membrane protease T, OmpT)位于细菌外膜，是大肠埃希菌的主要毒力相关因子之一[9]，可提高细菌抵抗宿主免疫系统的能力[10–11]，也是细菌进入中枢神经的黏附因子[4]，并介导细菌在尿路上皮细胞的定植[12]。此外，OmpT具有很高的免疫原性，能有效提高小鼠对致病性大肠埃希菌的免疫抵抗能力[13]，所以，OmpT有望成为候选的蛋白亚单位疫苗。本研究中利用分子克隆方法获得大肠埃希菌OmpT蛋白表达菌株；纯化OmpT蛋白，免疫小鼠，制备小鼠OmpT抗血清；通过正交试验确定OmpT适宜的表达条件与培养条件，旨在为OmpT工业发酵与疫苗开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

E. coli K12菌株、E. coli DH5a菌株、E. coli BL21菌株和pET–32a质粒均由陕西理工学院生物化学与分子生物学实验室保存。

1.1.2 主要试剂

DNA聚合酶、连接酶及内切酶购于大连宝生生物工程公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购于上海生物工程有限公司；IPTG购于BBI公司；二抗购于Sigma公司，基因测序在北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。其他试剂均为国产，分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组载体的构建

依据GenBank数据库公布的E. coli K12的全基因组序列设计 ompT 基因引物。引物序列为Sense和Anti– sense Primer(5′–gctctcgagttaaaatgtgtactta ag–3′)(下划线分别表示限制性内切酶的位点BamHⅠ和Xho Ⅰ)。PCR反应体系(25 μL)：PCR缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 μmol/L引物各1 μL，模板DNA 10 μL，Taq 酶0.2 μL，补水至25 μL。PCR循环参数：94℃预变性3min，然后进行30个循环(94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s)，最后72℃充分延伸10min，4℃保温。用PCR产物和pET–32a质粒载体进行双酶切，用连接酶连接后转化E. coli DH5a，并对重组质粒进行双酶切和测序鉴定，最后将重组质粒转化E. coli BL21表达菌株，进行OmpT表达[14]检测。

1.2.2 重组蛋白的表达检测与纯化

选取经鉴定后的重组菌接入LB(Amp)液体培养基中过夜培养，以1∶100转接到新鲜LB培养基中，待OD600nm约为0.5时，加入终浓度0.5 mmol/L 的IPTG，37℃诱导5 h，收集菌体，用蛋白电泳检测OmpT表达情况。利用SDS–PAGE电泳方法[15]对OmpT进行蛋白纯化。

1.2.3 小鼠多克隆抗体制备

将每只昆明鼠免疫OmpT蛋白50μg，第1次采用弗氏完全佐剂，免疫14 d后进行第2次免疫，第2次免疫7 d后，进行第3次免疫。第3次免疫7 d后于小鼠眼部取血，将血清置于4℃冰箱中过夜析出，离心取上清，–80℃冰箱中保存备用[15]。

1.2.4 蛋白抗体的效价与特异性检测

用ELISA法检测抗血清效价，主要步骤为：将OmpT蛋白溶解至0.05μg/μL，在对应的96孔板中加入100 μL抗原，37℃孵育3 h；倒空液体，清洗3次，加入300 μL封闭液，37℃孵育2 h，加100 μL不同稀释度小鼠抗血清(每种稀释度均有3个重复)，37℃孵育30min；充分洗涤后加入100 μL二抗(1∶3 000稀释)，37℃孵育30min；充分洗涤后，每孔加入50 μL底物A与50 μL底物B的混合液，37℃避光显色10min，迅速加入终止液，酶标仪[16]450 nm读数。

采用Western blotting方法检测OmpT小鼠抗血清特异性[17]，主要步骤为：将大肠埃希菌过夜培养，收集菌体，SDS–PAGE蛋白电泳，转NC膜，加入不同稀释度的小鼠抗血清(对照加入阴性抗血清)，洗涤后，加入二抗(1∶3 000稀释)孵育，洗涤后DAB显色。

1.2.5 OmpT 蛋白氨基酸序列系统进化树

利用NCBI数据库中已公布的细菌OmpT氨基酸序列，通过 MEGA5.02 软件进行聚类分析，并采用Neighbour–Joining 方法[14]构建系统发生树。

1.2.6 重组蛋白诱导表达条件的优化

选用L9(34)正交试验确定蛋白诱导表达的适宜条件。正交试验分为培养条件与蛋白诱导表达条件两部分[18]，试验的因子与水平见表1和表2。

表1 表达菌株培养条件正交试验的因子与水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for cultural condition of strain expression

表2 蛋白诱导条件正交试验的因子与水平 Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment for protein induced condition

OmpT表达菌株培养条件优化的正交试验：将重组菌株置于LB(Amp)液体培养基中过夜培养，以1∶100(体积)转接入新鲜培养基，按照正交试验模型要求培养，并记录所得菌液的OD600nm。

OmpT表达菌株诱导条件优化的正交试验：根据表达菌适宜培养条件试验结果，依照正交试验模型要求的不同条件培养至合适OD600nm，加入不同终浓度的IPTG诱导相应时间。分别吸取1mL菌液离心，将沉淀加入200 μL的2×SDS 上样缓冲液中，沸水煮样，并上样10 μL 进行SDS–PAGE电泳。使用Phoretix 1D软件对获得的蛋白电泳条带进行光密度分析。

2 结果与分析

2.1 重组载体的构建结果

图1 大肠埃希菌ompT基因的PCR扩增电泳结果 Fig.1 PCR amplification electrophoresis of E. Tgene

从大肠埃希菌基因组中PCR扩增到约1 000 bp的片段，片段大小与预期大小一致(图1)。将由PCR 扩增得到的目的基因与pET–32a质粒进行双酶切，通过连接酶连接转化DH5a菌株，提取重组质粒，双酶切，获得约1 000 bp的片段，片段大小与预测大小一致(图2)。基因测序结果表明，构建的ompT基因的序列与NCBI公布的序列相同，证明重组质粒克隆成功。

图2 重组质粒的双酶切结果 Fig.2 Results of recombinant plasmid digested by restriction enzyme

2.2 重组蛋白的表达与纯化结果

为检测重组蛋白的表达情况，将重组菌株经IPTG诱导，蛋白电泳获得相对分子质量约56 000的蛋白条带，其中包含约35 000的OmpT蛋白和20 400 的融合蛋白标签，其大小与预期大小一致；采用SDS–PAGE蛋白电泳切胶纯化获得的OmpT蛋白如图3所示。

图3 OmpT蛋白的表达与纯化电泳图谱 Fig. 3 Expression and purification electrophoresis of OmpT protein

2.3 小鼠抗血清效价与特异性检测结果

对获得的小鼠OmpT抗血清采用ELISA法检测，发现其抗体效价可以达到1∶1 600(图4)。Western blotting方法的分析结果表明，不同稀释度OmpT抗血清出现明显条带，而对照无对应条带(图5)，表明OmpT抗血清可与OmpT蛋白特异性结合，OmpT蛋白小鼠多克隆抗体被成功制备。

图4 OmpT 多克隆抗体效价的测定结果 Fig.4 Polyclonal antibody titer of the OmpT

图5 OmpT 多克隆抗体特异性的Western blotting 检测结果 Fig.5 Specificity of OmpT polyclonal antibody identification using Western blotting

2.4 OmpT 蛋白氨基酸序列系统进化分析

由图6可见，不同种大肠埃希菌有聚在一起的趋势，间接说明OmpT蛋白在不同种大肠埃希菌间具有同源性，可能存在交叉的免疫保护作用。

图6 OmpT 氨基酸序列系统进化树 Fig.6 Phylogenetic tree from OmpT amino acid sequences

2.5 重组菌株的诱导表达

2.5.1 菌株最适培养条件的正交试验结果

由正交试验结果(表3)的极差值(表4)可以看出，各因子对表达菌株生长的影响从大到小依次为培养基装液量、葡萄糖浓度、转速。由极差分析获得的表达菌培养的最优组合为a1b3c1(葡萄糖浓度为0，转速为230 r/min，培养基装液量为50mL)。表5方差分析结果显示，葡萄糖浓度、转速及装液量对表达菌株培养的影响达到显著水平。

表3 表达菌株的培养结果 Table 3 Results of the cultural experiment for strain expression

表4 表达菌株培养条件的极差分析结果 Table 4 Range results of cultural condition for strain expression

表5 表达菌株不同培养条件下OD600 nm 的方差分析结果 Table 5 Variance analysis of cultural condition for strain expression

2.5.2 OmpT 蛋白适宜诱导表达条件的正交试验结果

将正交试验获得的表达菌株进行SDS–PAGE电泳(图7)，用Phoretix 1D软件分析电泳条带图谱，获得蛋白条带的光密度值如表6所示。由表7中的极差分析结果可知，各因子对OmpT蛋白诱导表达的影响从大到小依次为诱导温度、IPTG诱导时菌体OD600nm、IPTG诱导终浓度、诱导时间。由极差分析获得最适宜OmpT蛋白表达的组合为e3f2g2h2(加IPTG诱导菌液的OD600nm为1.0，IPTG终浓度为0.3 mmol/L，诱导时间为8 h，诱导温度为32℃)。表8中的方差分析结果显示，加IPTG菌液浓度、IPTG诱导浓度及诱导温度3个因子对OmpT蛋白表达的影响达到显著水平。

图7 正交试验获得的OmpT 表达菌株SDS–PAGE 电泳图谱 Fig.7 SDS–PAGE electrophoresis of OmpT strain expression from orthogonal experiment

s表6 OmpT 蛋白表达各试验的光密度值 Table 6 Value of optical density from different expression experiments of OmpT protein

表7 OmpT 蛋白表达各试验光密度值的极差分析结果 Table 7 Range analysis on the value of optical density from different expression experiments of OmpT protein

表8 OmpT 蛋白表达各因子光密度值的方差分析结果 Table 8 Variance analysis on the value of optical density from different expression experiments of OmpT protein

3 结论与讨论

大肠埃希菌是导致奶牛乳房炎疾病的主要细菌之一，给奶制品业带来的损失巨大[7–8]。OmpT蛋白是大肠埃希菌主要的外膜蛋白之一，具有显著的免疫保护作用[13]，有望制备成奶牛乳房炎疾病的候选蛋白疫苗。本研究中构建大肠埃希菌OmpT表达菌株，获得纯化的OmpT蛋白，免疫小鼠制备了特异性较好的OmpT多克隆抗体，为OmpT功能研究奠定基础。此外，本研究发现OmpT氨基酸序列在不同种类大肠埃希菌间具有同源性，可能为不同种类的大肠埃希菌感染提供交叉免疫保护作用。

本试验结果表明：未诱导时，菌体适宜培养条件为葡萄糖浓度0 %，转速230 r/min，装液量50mL。有研究发现充足的氧气以及合适的转速有利于菌体的生长[19]。这与本实验证实提高培养基转速，减少装液量，可增加细菌对氧气、营养的充分吸收结果一致。在菌株IPTG诱导后，适宜OmpT蛋白诱导条件为：诱导时IPTG菌液OD600nm为1.0，IPTG终浓度0.3 mmol/L，诱导时间8 h，诱导温度32℃。IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质，高浓度的IPTG具有一定的细胞毒性，抑制蛋白的表达[20–21]。本试验结果进一步证实低浓度IPTG(0.3 mmol/L)有利于蛋白的表达。

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