马铃薯光响应StR2R3–MYB1 基因的克隆与表达分析

秦玉芝，邢铮，潘妃，熊兴耀,2*

(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

植物MYB 类转录因子以含有MYB 结构域为共同特征[1]。每个MYB 结构域以螺旋–转角–螺旋(helix–tum–helix，HTH)的形式结合于目标DNA 大沟处，调控目的基因的转录[2]。第1个植物myb 基因ZmMYBc1 是Paz–Ares 于1987年在玉米中发现的，ZmMYBc1 与动物myb 基因的同源性达40%[3]。不同作物中myb 基因的数量各异，在玉米中表达的myb 基因约有80个以上[4]，拟南芥中MYB 类转录因子有129个[5]，马铃薯中MYB 类转录因子有117个。MYB 类转录因子中以R2R3–MYB 的数量最多，其功能涉及植物次生代谢调控、细胞形态发生、激素刺激和环境胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等过程[6]。关于马铃薯MYB 类基因克隆和功能分析的报道尚少。在前期研究中，笔者发现了1个受光影响，并且对马铃薯花青素合成关键酶StCHS 基因表达具有明显正向作用的MYB 转录因子(GenBank: DQ917781.1)[7]，本研究中通过同源克隆，在马铃薯原始栽培种Yan 中获得了该转录因子(StR2R3– MYB1)的完整CDS 序列，并运用现代生物信息学技术对马铃薯StR2R3–MYB1 基因序列和蛋白质序列特征进行了比对、分析和预测，对基因表达的亚细胞定位、组织表达特异性及光照应答模式进行了分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

马铃薯原始栽培种 Yan(S. tuberosum subsp. andigena var. yanacochense)由湖南农业大学马铃薯工程技术中心种质资源库提供。拟南芥原生质体由湖南大学生命科学与技术研究院刘选明先生惠赠。表达载体pEGAD、pEGAD–MYC、PA7–YFP、大肠杆菌DH5α、农杆菌菌种Agl–0 均由湖南大学生命科学与技术研究院刘选明先生惠赠；T 载体pGM–T 购自天根生化公司。

1.2 方法

1.2.1 基因的克隆

根据表1 设计的引物，以由RNA 逆转录所得cDNA 为模板进行RT–PCR 。

表1 StR2R3–MYB1 克隆引物 Table 1 Primer sequences for StR2R3–MYB1 cloning

1.2.2 序列生物信息学分析的相关网站和软件

马铃薯基因组数据库网站：http://www. potatogenome.net/index.php/Main_Page。

蛋白结构域分析网站：http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/。

转录调控区域元件分析网站：PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。

蛋白一级结构预测网站：ProtParam(http://web. expasy.org/protparam/)。

卷曲螺旋结构预测网站：COILSServer(http: //embnet.vital–it.ch/software/COILS_form.html)。

三级结构预测网站：SWISS–MODEL(http:// swissmodel.expasy.org/)。

跨膜区域分析网站：TMHMM(http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)。

信号肽分析工具网站：SignalIP3.0(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

亲疏水性分析网站：http://www.expasy.ch/cgi– bin/protscale.pl。

同源性分析采用GeneDoc 软件。进化树构建采用MEGA5.0 软件。

1.2.3 实时荧光定量PCR

定量PCR 反应程序：95℃预变性10min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s， 45个循环。

内参为ActinB。所有检测样品均设置3次重复。定量引物见表2。

表2 StR2R3–MYB1 实时荧光定量PCR 引物 Table 2 qPCR primer sequences for StR2R3–MYB1

1.2.4 拟南芥原生质体转化

取20μg 重组质粒，加入100 μL 拟南芥原生质体和110 μL PEG 溶液，混匀，放置30min。加入440 µL W5 溶液，23℃、750 r/min 离心1min。

1.2.5 光处理

新继代的组培苗置于黑暗、22℃培养箱中生长12 d，形成白化苗。将白化苗分别置于白光、蓝光、红光、远红光培养箱中，于放置后0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 取样，–80℃保存。蓝光、红光、远红光和白光光源分别为LED–蓝光(波长为 470 nm)，LED–红光(波长为 660 nm)，LED–远红光(波长为740 nm)和白色荧光灯。

2 结果与分析

2.1 马铃薯StR2R3–MYB1 基因的克隆与同源性分析

经RT–PCR 扩增，获得1 条800 bp 的特异性片段。该片段包含1个全长798 bp 的CDS 序列，编码265个氨基酸长度的蛋白质，命名为StR2R3– MYB1。马铃薯StR2R3–MYB1 蛋白序列与番茄、茄子的同源性高达99%，与拟南芥MYB113 的同源性也在70%以上(图1～3)。

图1 StR2R3–MYB1 氨基酸序列系统进化分析结果 Fig. 1 Homology analysis for amino acid sequence of StR2R3 – MYB1

图2 StR2R3–MYB1 cDNA 序列与其氨基酸序列预测结果 Fig. 2 Prediction for cDNA and amino acid sequence of StR2R3–MYB1

图3 StR2R3–MYB1 氨基酸序列同源性分析的结果 Fig.3 Homology analysis for amino acid sequence of StR2R3–MYB1

2.2 StR2R3–MYB1 蛋白序列结构的分析

StR2R3–MYB1 蛋白全长265 aa，主要氨基酸为天冬氨酸(9.8%)、亮氨酸(9.4%)、甘氨酸(7.5%)和谷氨酸(6.8%)，正/负电荷残基数分别为32 和32，相对分子质量为30.23，分子式为C1316H2072N386O399S17，等电点为6.95，不稳定系数为47.52(＞40)，稳定性弱，没有跨膜信号，蛋白氨基酸序列不存在卷曲螺旋。StR2R3–MYB1 蛋白的疏水区域分布比较均衡，疏水性氨基酸多于亲水性氨基酸，但其N 端具有明显的亲水区域（图4）。

2.3 StR2R3–MYB1 核酸序列的结构

StR2R3–MYB1 基因位于马铃薯10 号染色体的51 749 197～51 750 359 bp，基因全长1 163 bp，由3个外显子和2个内含子构成。CDS 序列中含有2个DNA–结合结构域，分别位于第21～71 aa 和第74～122 aa，属于R2R3 类MYB 转录因子，将该基因命名为StR2R3– MYB1。对启动子顺式作用元件[8]进行分析的结果表明，StR2R3–MYB1 基因的调控区域存在大量与光相关的元件，如G–Box、Box4、BoxⅡ、I–Box、MNF1 等，还存在脱落酸诱导相关元件ABRE、生物钟相关元件Circadian 和茉莉酸甲酯相关元件CGTCA– motif (图5)。

图4 StR2R3-MYB1 蛋白疏水性/亲水性预测结果 Fig. 4 StR2R3-MYB1 protein hydrophobic/hydrophilic prediction

2.4 StR2R3–MYB1 蛋白的亚细胞定位分析

将构建好的StR2R3–MYB1 与YFP 融合蛋白表达载体转化拟南芥原生质体，在激光共聚焦扫描显微镜下观察基因的亚细胞定位情况，可见StR2R3–MYB1∷YFP 融合蛋白定位在细胞核内 (图6)。

2.5 StR2R3–MYB1 基因表达模式的分析

实时荧光定量PCR 分析结果显示，StR2R3– MYB1 在根、茎、叶的相对表达量依次升高(表3)。

表3 StR2R3–MYB1 基因在不同组织部位的相对表达量 Table 3 Gene expression pattern analysis for StR2R3–MYB1

2.6 光调节StR2R3–MYB1 基因的表达

黑暗培养12 d 的马铃薯白化苗转移至白光下生长0、0.5、2、4、8、12、24 h 的StR2R3–MYB1基因表达量随光处理时间的延长呈上升趋势(图7)， StR2R3–MYB1 的表达受到了白光的诱导。分别用红、蓝和远红光处理白化苗后，3 种单色光都能诱导StR2R3–MYB1 的表达，其中远红光、蓝光诱导4 h 时，StR2R3–MYB1 的表达量出现第1个峰值，随后下降，在12 h 后回升。红光对StR2R3–MYB1 的诱导作用在8 h 后开始显现(图7)。

图7 光调节StR2R3–MYB1 基因的表达 Fig. 7 Expression of light regulationgene of StR2R3–MYB1

3 结论与讨论

在植物响应逆境胁迫的信号传导系统中，转录因子起着重要的作用。序列分析结果表明，马铃薯StR2R3–MYB1 与其他MYB家族转录因子在DNA 结合域具有高度保守性，属于典型的R2R3 类型MYB 转录因子。核苷酸序列和氨基酸序列分析结果表明，StR2R3–MYB1 的调控区域存在大量与光相关的元件，如G–Box、Box4、BoxⅡ、I–Box、MNF1等，还存在脱落酸诱导相关元件ABRE、生物钟相关元件Circadian、茉莉酸甲酯相关元件CGTCA。StR2R3–MYB1 的转录很可能受光信号及环境胁迫的诱导。StR2R3–MYB1 氨基酸序列上没有跨膜信号，不存在卷曲螺旋，具有明显的亲水区域，氨基酸残基与水分子的相互作用较强，表明该蛋白的稳定性较低。亚细胞定位分析发现StR2R3–MYB1 蛋白在细胞核中表达，这正符合转录因子的亚细胞定位特征。系统进化分析结果表明，StR2R3–MYB1 与拟南芥AtMTB113、AtMTB90 和茄子SmMYB 及番茄SlCMYB1 同属于1个亚族。该亚族MYB 转录因子的功能多数与花青素合成相关，如AtMTB113 与花青素积累有关[8–9]，而AtMTB90 与色素合成相关[10]，SmMYB 与花青素合成相关[11]，SlCMYB1 则与冷诱导、低温胁迫相关[12]。笔者的前期研究[7]中运用多因子及其互作逐步回归法建立光照度、温度和处理时间影响基因表达的模式，发现环境温度与StR2R3–MYB1 和StPAL、StDFR 基因的表达量呈负相关，环境光照度与StR2R3–MYB1 和StCHS、StDFR的表达呈正相关。马铃薯StR2R3–MYB1 转录调节因子对StCHS 基因的表达具有明显正向影响。本研究中StR2R3–MYB1 蛋白结构分析、蛋白功能预测、基因组织表达特性分析及光处理后基因表达特性分析等研究结果，使前期研究中的推断StR2R3–MYB1 与受光和低温调节的马铃薯花青素合成相关[7]得到了进一步的印证。

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