龙葵果生物碱提取纯化工艺研究

高小棠，王萍

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

龙葵(Solanum nigrum L.)别名龙眼草、黑天天等，是茄科草本植物，主要分布于中国的黑龙江、吉林、辽宁等省。龙葵全草含甾体类生物碱、龙葵多糖、色素、皂苷等，其主要药用成分为生物碱和甾体多糖[1]。有研究[2–3]表明，龙葵甾体类生物碱主要是由以澳洲茄胺为苷元的生物碱组成，而目前澳洲茄胺的主要提取来源就是龙葵。澳洲茄胺苷元存在于龙葵果和龙葵茎叶中，在龙葵果中含量最高。笔者以龙葵果为试验原料，以龙葵果中生物碱含量作为定量检测指标，采用响应面法优化龙葵果生物碱提取工艺，利用大孔树脂的吸附作用，对龙葵果生物碱进行纯化，并考察最佳纯化条件。

1 材料与方法

1.1 材料

供试龙葵果采自哈尔滨郊区。

主要供试试剂：澳洲茄胺标品(索莱宝公司)；二氯甲烷(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；无水氯化钙(天津市风船化学试剂科技有限公司)；溴麝香草酚蓝(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

主要供试仪器：HR2004 榨汁机(飞利浦电子香港有限公司)；RE–53A 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB–IIIS 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；722 型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；PHS–26 数显pH 计(上海精密试验仪器有限公司)；HHS 型电热恒温水浴锅(北京博迅实业有限公司医疗设备厂)；TDL–40B–W 台式低速大容量离心机(上海星科科学仪器有限公司)；(1×50) cm 玻璃层析柱(上海精科实业有限公司)；AB–8、D101、X–5(天津市汇达化工有限公司)；HP2MGL、NKA–Ⅱ、IR120Na(浙江嘉兴玛雅试剂)；XAD–7(阿法埃沙(天津)化学有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 龙葵果生物碱的提取

1) 标准曲线的绘制。在紫外分光光度计上，将澳洲茄胺标准品和龙葵果生物碱提取液在190～900 nm 波段扫描，二者均在416 nm 波长下有最大吸收峰，确定生物碱的最大吸收波长为416 nm。

分别移取质量浓度为0.400mg/mL 的澳洲茄胺标准品溶液20、40、80、120、160 μL 至25mL锥形瓶中，蒸干溶剂，加入pH 7.6 的溴麝香草酚蓝指示液6mL，参照周琴音、Markus Ganzera 等[4–5]方法，再加入二氯甲烷5mL，充分振荡，转移入分液漏斗，静置2 h，待有机层与水层完全分离后，取有机层，加无水氯化钙，干燥有机层。然后采用分光光度法在416 nm 波长下测定吸光值，以不含生物碱的二氯甲烷萃取液作为空白对照。以澳洲茄胺浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线[6]。

2) 溶剂的筛选。采用溶剂萃取法提取龙葵果生物碱。参照文献[7–11]的方法，分别取10.0g 新鲜龙葵果按料液比(1∶20)g/mL 加入水、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%的乙醇，60%、70%、90%、95%、100%的甲醇，用榨汁机打匀， 40℃恒温水浴浸提4 h，4 000 r/min 离心5min，取上清液，定容至一定体积，采用分光光度法在416 nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算龙葵果生物碱含量。

3) 单因素试验设计。通过溶剂的筛选，比较得出较好的提取溶剂；采用较好提取溶剂，设提取时间(2、3、4、5、6、7、8 h)、提取温度(20、40、60、80、100℃)和料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100)g/mL 的单因素试验，比较龙葵果中生物碱的提取得率。

1.2.2 响应面优化龙葵果生物碱提取工艺

在单因素试验的基础上，对提取温度、提取时间和料液比3个因素做全因子试验设计[12]。通过全因子试验，找出显著因子并确定其影响效应。根据显著因子的影响效应确定爬坡方向和变化步长，设计出最陡爬坡路径[13]。以最陡爬坡试验确定的水平作为中心组合试验设计的中心点，采用中心旋转组合试验设计法进行响应面分析。

1.2.3 龙葵果生物碱的纯化

1) 树脂的预处理。用95%乙醇浸泡各树脂24 h，使树脂充分润胀[14]，蒸馏水水洗至无醇味，用5% HCl 浸泡12 h，蒸馏水洗至中性，再用5% NaOH浸泡12 h，蒸馏水水洗至中性。

2) 最佳树脂的筛选。准确称取2.0g 已活化的树脂于100mL 的具塞锥形瓶中，加入20mL 龙葵果生物碱提取液，20℃，110 r/min 恒温水浴振摇24 h，达到吸附平衡，测定吸光值，计算上清液中生物碱含量。移除残余溶剂，用蒸馏水清洗树脂3次，用20mL，60%乙醇在20℃，110 r/min 恒温水浴振摇24 h 进行解吸，充分解吸后测定上清液中生物碱含量，计算吸附量和解吸率[15]。

3) 龙葵果生物碱吸附平衡和解吸平衡时间的测定。准确称取筛选出的最佳树脂2.0g 于100mL的具塞锥形瓶中，加入20mL龙葵果生物碱提取液，20℃，110 r/min 恒温水浴振荡吸附，每1 h 测定上清液生物碱含量。以吸附时间为横坐标，吸附量为纵坐标，绘制静态吸附曲线。将上述吸附平衡后的树脂过滤除去溶剂，用蒸馏水洗涤树脂3次，并用滤纸吸干树脂表面的水分，加入20mL 60%乙醇溶液，置于恒温振荡器中20℃，110 r/min 恒温水浴振荡解吸。每1 h 测定上清液生物碱含量。以吸附时间为横坐标，解吸率为纵坐标，绘制解吸曲线。

4) 泄漏曲线的确定。将筛选出的最佳树脂装柱，控制上样液流速2.0 BV/h，4mL /管，测定生物碱含量，当生物碱浓度为上样浓度1/10 时视为开始泄漏，泄漏前一点为最大上样量[16]。

5) 龙葵果生物碱纯化工艺优选。分别考察上样液浓度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL)、洗脱剂浓度(50%、60%、70%、80%、90%)、上样液pH(3、5、7、9、11)，洗脱剂pH(3、5、7、9、11)，洗脱流速(0.5、1.0、2.0、4.0 BV/h)和径长比(1∶5、1∶10、1∶15)对树脂吸附的影响，测定洗脱液中生物碱含量，计算回收率[17]。

回收率=(m1/m0)×100%。式中，m0为上样液中生物碱质量(g)；m1为洗脱液中生物碱质量(g)。

6) 洗脱剂体积的确定。将到达吸附平衡的树脂用2.0 BV 的蒸馏水洗至无糖类等可溶性成分，加入pH 3.0 的70%乙醇洗脱，控制洗脱流速2.0 BV/h， 4mL/管，测定生物碱含量，当洗脱液中检测不出生物碱时为洗脱完全，此时的体积为洗脱剂体积。

1.2.4 数据处理与分析

采用Excel 软件进行数据分析及制图；采用Minitab 软件进行全因子试验设计及分析；Design–Expert 8.0 软件进行中心组合试验设计及响应面分析。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取物中的生物碱得率

在416 nm 下测定吸光值，绘制成标准曲线，获得标准曲线方程y=46.256x+0.001 9，R2=0.999 9，表明澳洲茄胺浓度在0.001 6～0.012 8mg/mL 内，浓度与吸光值线性关系良好。

由标准曲线计算不同提取溶剂龙葵果生物碱得率，结果以60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%的乙醇为提取溶剂时的龙葵果生物碱得率分别 为(0.27±0.04) 、 (0.33±0.03) 、 (0.64±0.01) 、(0.59±0.01)、(0.48±0.02)、(0.35±0.01)、(0.24±0.04)mg/g；以70%、90%、95%、100%的甲醇为提取溶剂时龙葵果生物碱得率分别为(0.18±0.03)、(0.30±0.02)、(0.66±0.02)、(0.65±0.04)、(0.37±0.01)mg/g；以蒸馏水作为提取溶剂时龙葵果生物碱得率为(0.22±0.01)mg/g。从上述结果可知，当乙醇和甲醇的浓度分别为80%和90%时，生物碱的提取率达到最高，差异没有统计学意义，考虑到溶剂毒性问题和实际生产的经济效益，选择80%乙醇作为提取溶剂。

2.2 生物碱提取单因素试验结果

以80%乙醇为溶剂提取龙葵果生物碱，当提取时间分别为2、3、4、5、6、7、8 h 时，提取得率相应为 (0.40±0.01)、(0.53±0.01)、(0.64±0.01)、(0.63±0.02)、(0.65±0.04)、(0.65±0.02)、(0.65±0.02)mg/g，可见，龙葵果生物碱在提取4 h 时已基本提取完全；当提取温度为20、40、60、80、100℃时，提 取 得 率 分 别 为(0.54±0.01) 、 (0.65±0.01) 、(0.64±0.01)、(0.52±0.02)、(0.14±0.01)mg/g，可见提取温度40℃时龙葵果生物碱得率最大；当料液比为(1∶5)、(1∶10)、(1∶20)、(1∶40)、(1∶60)、(1∶80)、(1∶100)g/mL 时，提取得率分别为(0.31±0.01)、(0.60±0.04)、(0.64±0.01)、(0.46±0.03)、(0.40±0.02)、(0.27±0.01)、(0.26±0.01)mg/g，可见料液比为(1∶20)g/mL 时，龙葵果生物碱得率最大。

2.3 响应面优化龙葵果生物碱提取工艺

2.3.1 全因子试验结果

将试验数据拟合，得到方程：

式中A 为提取温度，B 为提取时间，C 为料液比。从(1)中可见，该模型P ＜ 0.001，说明该模型极显著，决定系数R2=99.79%，说明该模型拟合程度良好。显著性影响大小的因素依次为料液比(C)、提取温度(A)、提取温度与料液比互作(AC)。

2.3.2 最陡爬坡试验结果

根据(1)中的系数确定提取温度和料液比的变化步长进行最陡爬坡试验。通过试验结果找出生物碱得率最高的方案为提取温度50℃，料液比(1∶20)g/mL。

2.3.3 中心组合试验结果

以最陡爬坡试验找出的最佳点作为中心点，进行中心组合试验。将中心组合试验数据进行拟合，得到模拟方程：

该模型P ＜ 0.000 1，说明该模型极显著；失拟误差P ＞ 0.05，说明没有产生失拟现象；R2=97.21%，说明拟合度良好，方程的显著性及可靠性极高[18]。根据以上方程绘制响应面图形，得到图1。运用Design–Expert 8.0 软件进行分析，得到模型的最佳点，即当提取温度为57.52℃，料液比为(1∶20.54)g/mL，生物碱提取率最高，理论上可以达到0.833mg/g。

图1 提取温度和料液比交互作用下龙葵果生物碱得率的影响 Fig.1 Effects of temperature and liquid-solid ratio on alkaloids yield

2.3.4 模型的验证结果

通过响应面得到的最佳提取条件，提取温度为57.5℃，料液比为(1∶20.5)g/mL，考虑到实际生产中要节约时间，选择提取时间为4 h，在此条件下提取龙葵果生物碱得率为(0.824±0.001)mg/g，与模型预测误差值仅为1.1%，说明预测较可靠，通过试验得出的试验参数与实际拟合较好。

2.4 最佳树脂筛选结果

从表1 可以看出，AB–8 树脂有较好的吸附和解吸效果，是纯化龙葵果生物碱较理想的树脂。

表1 树脂静态吸附及解吸结果 Table 1 Absorption and desorption capabilities of the different macroporous resins to S. nigrum anthoyanins

2.5 龙葵果生物碱吸附平衡和解吸平衡时间的测定

根据试验结果绘制吸附曲线(图2)和解吸曲线(图3)。从图2 和图3 可以看出，AB–8 树脂在4 h基本达到吸附平衡和解吸平衡，因此，在纯化龙葵果生物碱的工艺中可将吸附和解吸时间确定为4 h。

图2 AB–8 树脂静态吸附曲线 Fig. 2 Static adsorption curve of AB–8

图3 AB–8 树脂静态解吸曲线 Fig. 3 Static desorption curve of AB–8

2.6 泄漏曲线的确定

从图4 可以看出，随上样液体积的增加，流出液中生物碱含量也在不断增加，说明树脂对生物碱的吸附效果在降低。当流出液中生物碱浓度达到上样液生物碱浓度的1/10 时视为泄漏，即0.60 BV 为最大上样量。

图4 泄漏曲线 Fig. 4 Leaked curve

2.7 不同条件对龙葵果生物碱纯化工艺的影响

当上样质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL 时，龙葵果生物碱的回收率分别为25.45%、33.56%、63.17%、43.18%、33.41%。由此可见，上样质量浓度为0.03mg/mL 时回收率最大，因此，选择0.03mg/mL 为最佳上样质量浓度。

当洗脱剂(乙醇)体积分数为50%、60%、70%、80%、90%时，龙葵果生物碱的回收率分别为18.83%、77.45%、90.98%、53.40%、33.41%，由此结果可知，乙醇体积分数为70%时回收率最大，因此，选择70%乙醇作为最佳洗脱剂。

当上样液pH 为3、5、7、9、11 时，龙葵果生物碱回收率分别为38.07%、51.53%、64.23%、73.85%、41.45%，上样液pH 9 时回收率最大，因此，选择pH 9 为最佳上样pH 值。

当洗脱剂pH 值为3、5、7、9、11 时，龙葵果生物碱回收率分别为93.69%、79.78%、76.18%、75.05%、34.62%，洗脱剂pH 3 时回收率最大，因此，选择pH 3 为最佳上样pH 值。

当洗脱剂流速为0.5，1.0，2.0，4.0 BV/h，龙葵果生物碱回收率分别为56.56%、54.23%、65.54%、52.95%，可见，洗脱剂流速为2.0 BV/h 时回收率最大，因此，选择2.0 BV/h 为最佳洗脱流速。

当径长比为1∶5、1∶10、1∶15 时，龙葵果生物碱回收率分别为67.46%、76.03%、71.97%，可见径长比为1∶10 时回收率相对较高，因此，选择1∶10 作为最佳径长比。

2.8 洗脱剂体积的确定

根据试验结果绘制洗脱曲线(图5)。从图5 可以看出，随洗脱液体积增加，洗脱液中生物碱含量不断升高，在2.0 BV 处达到洗脱高峰，此时洗脱出的生物碱占总量的44.72%；洗脱剂用量3.0 BV 时，可洗脱出占总量84.33%的生物碱；洗脱剂用量为4.6 BV 时，在洗脱液中检测不到生物碱，因此，3.0 BV 洗脱液即可较完全洗脱生物碱。

图5 洗脱曲线 Fig. 5 Eluent volume

3 结论与讨论

龙葵果中生物碱的提取过程涉及到的各因素都会对提取得率产生影响。本试验中，龙葵果生物碱的提取得率随提取溶剂浓度的上升而增加，原因可能是甲醇和乙醇能够沉降龙葵果中的蛋白质、多糖、纤维素等高分子物质[12]，减少生物碱溶出的阻力，加大生物碱的溶出速率和溶出量。但当甲醇和乙醇的浓度继续升高(分别高达90%和80%)时，生物碱的提取率反而下降，这是由于高浓度的甲醇和乙醇溶液会加速龙葵果中脂类物质的溶出。当脂类物质与生物碱共存时，在碱性条件下易发生乳化，使提取不完全。随着提取时间的延长，生物碱的提取率也增加。但当提取时间达到4 h 后，提取时间继续增加，生物碱的提取率基本没有变化。说明在该提取条件下，龙葵果中的生物碱在4 h时已经基本被浸提出。随着提取温度的升高，龙葵果生物碱的提取率先逐渐增加，然后迅速降低。由于龙葵果中的生物碱热稳定性较好，因此，在较高温度下提取率的下降可能是由于溶剂挥发而导致生物碱提取不完全造成的。随着料液比的增加，生物碱提取率不断增加，超过(1∶20)g/mL 时提取率有所下降。料液比增加，即溶剂量增加，能够加大生物碱的溶出量，但料液比过大，会增加龙葵果中的脂类物质的溶出，脂类物质与生物碱在碱性条件下乳化，使得提取不完全，造成生物碱提取率降低。

龙葵果生物碱的纯化工艺受上样浓度、洗脱剂的浓度、上样pH、洗脱剂pH、洗脱剂流速、径长比等因素的影响。上样浓度低，不仅纯化效率低，而且吸附效果不明显；上样浓度过高，会降低生物碱在水溶液中的溶解性，影响树脂的洗脱效果。本研究结果表明，70%乙醇为洗脱剂、洗脱剂为酸性(pH3)以及上样液偏碱性(pH9)时，龙癸果生物碱回收率较高。因为，生物碱在碱性条件下稳定，能较好的吸附在树脂上，若在酸性条件下吸附，生物碱会质子化，形成相应的生物碱盐。不带功能基团的大孔树脂不易吸附盐类，而生物碱盐易溶于水，会随糖类等水溶性成分一起被洗脱而不易被大孔树脂吸附。在酸性条件下洗脱，被吸附在树脂上的游离态生物碱与H+结合形成生物碱盐，生物碱盐不易与大孔树脂结合而易被洗脱下来。洗脱流速过快，洗脱剂未能与吸附在树脂上的生物碱充分作用，洗脱不完全；洗脱过慢耗时长，延长生产周期。径长比过低，杂质并不能被很好的去除，使生物碱纯度低；径长比过高，生物碱洗脱路径长，会造成生物碱洗脱不完全，使回收率下降。

综合整个试验结果，得出以下结论：

80%乙醇提取龙葵果生物碱的提取率最高；在提取温度57.5℃，提取4 h，料液比(1∶20.5)g/mL 下提取龙葵果生物碱，提取率为(0.824± 0.001)mg/g；AB–8 树脂为纯化龙葵果生物碱的较佳树脂；龙葵果生物碱在AB–8 树脂上的吸附平衡时间为4 h，解吸平衡时间为4 h，最大上样量为0.60 BV，最佳上样浓度为0.03mg/mL，最佳上样pH 9，最佳径长比1∶10，用3.0 BV，pH 3 的70%乙醇即可将龙葵果生物碱洗脱较完全，最佳洗脱流速为2.0 BV/h。在此条件下可将龙葵果生物碱纯度提高9.44 倍。

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