整合素αvβ3抑制剂RGDfv对人骨肉瘤F5M2细胞系增殖及凋亡的影响

王民，马照雨，王莹，刘建新，韩学哲

·临床论著·

整合素αvβ3抑制剂RGDfv对人骨肉瘤F5M2细胞系增殖及凋亡的影响

王民，马照雨，王莹，刘建新，韩学哲

（西安交通大学第一附属医院骨外科，西安，710061）

目的 研究整合素αvβ3抑制剂RGDfv对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法 通过MTT法检测不同浓度RGDfv序列肽对F5M2细胞生长增殖的抑制作用；通过Western blot方法观察经RGDfv诱导48 h的F5M2细胞中凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表达。结果 MTT法检测结果显示经不同浓度RGDfv序列肽处理的F5M2细胞增殖受到抑制，OD值明显减少，并且呈浓度及时间依赖性（P<0.05 or 0.01）；RGDfv处理后的F5M2细胞中，随着RGDfv浓度的升高，cleaved Caspase-3的表达量也较对照组明显增加（P<0.05）。结论 RGDfv序列肽能抑制F5M2细胞的增殖，并通过依赖于Caspase-3的通路诱导骨肉瘤F5M2细胞凋亡。

骨肉瘤，整合素，细胞增殖，细胞凋亡

整合素是一类细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子，介导肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移以及肿瘤血管的形成[1]。整合素αvβ3在骨肉瘤中高表达，而在良性骨肿瘤及正常骨组织中不表达，抑制整合素αvβ3能否影响骨肉瘤细胞的增殖和凋亡还不清楚。

本试验研究整合素αvβ3抑制剂RGDfv序列肽对F5M2细胞生长增殖的抑制作用，并探索对骨肉瘤细胞中凋亡因子caspase-3的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系 成骨肉瘤细胞系F5M2由第四军医大学唐都医院全军骨科中心暨全军骨肿瘤研究所提供。

1.2 主要试剂及药物 整合素αvβ3抑制剂RGDfv购自Enzo life science公司；DMEM高糖培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司；胰蛋白酶购自Hyclone公司；Western blot试剂盒购自西安晶彩生物科技有限公司；Caspase-3免抗人多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。其它生化试剂：青链霉素混合液、Tris碱、叠氮钠、二甲苯、琼脂、琼脂糖、甲醇及异丙醇等为进口或国产分装试剂。

1.4 MTT实验 接种细胞：取指数生长期的F5M2细胞，经胰酶消化并计数，调整细胞密度为2.5×104个/ ml。接种于96孔板，每孔200 ul（约5×103个细胞）。待细胞完全贴壁后，更换含有不同浓度RGDfv的培养液，实验分5组：RGDfv组，加200 ul含不同浓度RGDfv的培养液（20 ug/ml、30 ug/ml、40 ug/ml、50 ug/ml）；空白对照组，在200 ul DMEM培养液加入10 ul的PBS。每组5复孔。细胞分别培养24 h、48 h和72 h后，加入20 ul的MTT（5 mg/ml），继续培养4 h后吸取培养液，每孔加入150 ul DMSO溶解结晶，充分振荡10 min，用酶标仪测定各孔在490 nm的光吸收值（OD值）。

1.5 Western blot检测 caspase-3的表达 选择RGDfv培养基培养48 h后的细胞进行Western blot实验。用细胞裂解液裂解细胞后，取30 ug细胞总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，按湿转法将电泳产物转移到NC膜，5%脱脂奶粉4℃封闭2 h，滴加一抗（1：200）4℃过夜，选择Tubulin作为内参。TTBS洗膜10 min×4次，滴加二抗（1：3000）37℃孵育2 h，按试剂盒说明进行显色，凝胶成像仪采集图像，并运用Image J图像软件计算灰度。

1.6 统计学方法 计量数据采用均数±标准差记录，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间比较采t检验。

2 实验结果

2.1 不同浓度的RGDfv对F5M2细胞生长的抑制作用 与对照组相比较，RGDfv对F5M2细胞具有抑制作用（P<0.05 or 0.01），而且其抑制作用呈浓度和时间依赖性。不同浓度和不同时间的RGDfv处理对F5M2细胞OD值影响见图1。

2.2 Western blot检测F5M2细胞caspase-3的表达不同浓度RGDfv组的骨肉瘤细胞F5M2中，均有caspase-3的表达（图2.A），且随着RGDfv浓度的升高，cleaved Caspase-3的表达量也随之增加（图2. B）（P<0.05）。

图1 不同浓度和不同时间的RGDfv处理对F5M2细胞生长的抑制作用 P<0.05，*P<0.01

图2 Western blot检测不同浓度RGDfv对F5M2细胞cleaved Caspase-3的表达的影响A：cleaved Caspase-3表达条带，B：cleaved Caspase-3表达量统计柱形图。

3 讨论

整合素是一类细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子。对细胞和细胞外基质，细胞与细胞之间的粘附起介导作用。整合素所介导的粘附作用可调节多种细胞功能，包含细胞凋亡、细胞粘附与迁移、细胞增殖和淋巴细胞归巢等。

整合素αvβ3在组织内的分布具有时相性和特异性，在肿瘤新生血管及炎症组织的血管新生内皮细胞，整合素αvβ3有高水平表达；一些浸润性肿瘤细胞，如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等也有整合素αvβ3的表达。早期的大量体外研究表明，整合素αvβ3对肿瘤新生血管具有促进作用，通过抑制整合素功能可以明显减少肿瘤新生血管的产生[2，3]。并且通过抑制整合素还对肿瘤细胞的侵袭能力产生明显的抑制。因此以整合素为靶点的肿瘤治疗方法，成为了研究热点。但是随着整合素抑制剂逐步的进入临床试验后，研究者们发现，整合素抑制剂除了对少部分肿瘤起抑制作用（如对神经胶质瘤有明显抑制作用[4-6]），目前没用明确的证据表明其他类型的肿瘤也同样有效[7-10]。因此以整合素αvβ3为靶点的治疗方案还需进一步的研究。整合素αvβ3在骨肉瘤中的研究主要集中在其对肿瘤血管的作用及其对肿瘤侵袭性的研究，而整合素αvβ3对肿瘤细胞凋亡影响的研究较少，因此本部分试验主要研究整合素αvβ3抑制剂对骨肉瘤细胞凋亡的影响。

本研究的MTT结果提示，用RGDfv抑制整合素αvβ3可以抑制胶质瘤细胞的增殖。在凋亡过程中，Caspase-3是关键的效应分子。Caspase-3平时是以pro-Caspases-3这种未活化态的形式存在于细胞中，当凋亡通路激活，pro-Caspases-3可被切割形成cleaved caspase-3（17kD）活化形态。实验中通过采用Western blot方法，检测RGDfv处理48 h后细胞cleaved Caspase-3的表达，发现在不同浓度RGDfv组的骨肉瘤细胞F5M2中，均有cleaved Caspase-3的表达，且在一定浓度条件下随着RGDfv浓度的升高，cleaved Caspase-3的表达量也随之增加。这些结果表明整合素αvβ3 RGDfv序列肽能抑制骨肉瘤细胞的增殖，并通过依赖于Caspase-3的通路诱导骨肉瘤F5M2细胞凋亡。

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The effects of RGDfv-an inhibitor of integrin αvβ3 on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line F5M2

WANG Min，MA Zhao-yu，WANG-Ying，et al
（Department of Bone Surgery,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University College of Medicine，Xi'an,Shanxi 710061，China）

Objective To study the effects of RGDfv peptide，an inhibitor of integrinαvβ3，on proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells.Methods MTT method was used to explore the inhibitory effect of RGDfv on proliferation of osteosarcoma cells by comparing the OD values，and Western blot technology was used to detect the expression changes of cleaved Caspase-3 induced by RGDfv peptide with different concentrations.Results A concentration and temporal -dependent decreases of OD values in experimental cells with RGDfv peptide were demonstrated compared with control cells.（P<0.05 or 0.01）When compared with control，the expression of cleaved Caspase-3 increased significantly in cells with different concentrations of iRGDfv peptide （P<0.05）.Conclusion iRGDfv peptide could inhibit the proliferation of F5M2cells，and induce the apoptosis of F5M2cells by a Caspase-3 dependent pathway.

osteosarcoma；integrin；cell proliferation；apoptosis

R738

A

1005-7234（2015）05-0357-03

10.3969/j.jssn.1005-7234.2015.05.003

2014-12-01;

2015-02-09

陕西省自然科学基金(2012K13-02-25)

王民（1956-），男，陕西籍，主任医师，教授

研究方向：骨关节病，骨肿瘤

韩学哲

电 话：13991117171

电子信箱:hanjianran@163.com