截短侧耳素衍生物BC-7013在鸡体内的药物动力学和生物利用度研究

杨德学，陈良柱，赖丽虹，任妙贤，张桂君，潘志坤，方炳虎

(1 华南农业大学 兽医学院，广东 广州510642;2 广东大华农动物保健品股份有限公司，广东 新兴527439)

截短侧耳素(Pleuromutilin)是由高等真菌担子菌纲侧耳属Pleurotsmutilus 和Pleurotus passeckeranius菌种经深层培养产生的一种二萜类抗生素．截短侧耳素类主要是开发成动物专用抗生素，如泰妙菌素(Tiamulin)和沃尼妙林(Valnemulin)，主要用于畜禽病原菌感染引起的呼吸道疾病的防治，尤其对支原体感染有特效［1］．据Hanna 等［2］报道，泰妙菌素对猪肺炎支原体的MIC50为0.039 μg·mL－1，对鸡败血支原体的MIC50为0.042 μg·mL－1，而沃尼妙林对猪肺炎支原体的MIC 为0.000 5 μg·mL－1，对猪滑液支原体的MIC 为0.000 1～0.000 25 μg·mL－1．2007年截短侧耳素类抗生素瑞他妙林(Retapamulin)上市［3］．截短侧耳素类抗生素的共同抗菌作用机制是独特地与细菌50 S 核糖体结合，抑制细菌蛋白质的合成，因此与其他抗生素较少发生交叉耐药［1］，成为近期抗生素研究的一个新热点．随着研究的深入，更多的截短侧耳素类衍生物被发现，而衍生物BC-7013(其分子式为C29H40SO5，相对分子质量为500.28)是由Nabriva Therapeutics 公司开发的截短侧耳素类新衍生物，主要用于细菌感染治疗，尤其是针对耐药菌的感染［4］．衍生物BC-7013 的药效研究［5］表明:衍生物BC-7013 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC90为0.03 μg·mL－1，对耐青霉素的肺炎链球菌MIC 为0.06 μg·mL－1，对凝固酶阴性葡萄球菌的MIC90范围为0.03～0.25 μg·mL－1．华南农业大学药理研究室研究发现，衍生物BC-7013 对鸡毒支原体有显著的抑制活性(MIC＜0.000 25 μg·mL－1，另文发表)．本文采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)内标法定量测定血浆中衍生物BC-7013 的浓度，对截短侧耳素衍生物BC-7013 经单剂量静脉注射(简称静注)和口服在鸡体内的药物动力学(简称药动学)特征及生物利用度进行研究，旨在为新型动物专用截短侧耳素类抗生素的研发提供依据．

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 仪器与试剂 Agilent 1200 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司产品;API 400 电喷雾-串联四级杆质谱仪，配置Analyst 1.5 软件，美国应用生物系统公司产品;AT-261 型电子分析天平，瑞士Mettle 公司产品;5804(R)/5801(R)型台式高速离心机，德国Eppendorf 公司产品．截短侧耳素衍生物BC-7013(结构式见图1)由广东大华农动物保健品股份有限公司技术中心提供(批号:130511)．沃尼妙林酒石酸盐对照品，质量分数为98.7%，批号907-F67029，由百灵威化学有限公司提供．衍生物BC-7013 的溶解剂为乙醇、聚乙二醇400 和超纯水．甲醇、乙腈为色谱纯，均为美国Fisher 公司产品;水为超纯水;其余试剂均为分析纯．

图1 衍生物BC-7013 的结构式Fig．1 Structure of derivative BC-7013

1．1．2 试验动物 6 周龄20 只健康白羽鸡，雌雄各半，体质量(2.0 ±0.3)kg，自由饮水和采食．试验时随机分成2 组，每组10 只，并称量记下各自的体质量．给药前禁食12 h，自由饮水，给药后禁饲4 h．

1．2 方法

1．2．1 色谱条件 液相色谱柱:ZORBAX SB-Aq C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm，美国Agilent 公司)．流动相:体积分数为0.1%甲酸水溶液(A)+ 体积分数为0.1%甲酸乙腈(B)，流速:0.25 mL·min－1．梯度洗脱:在0～1.0 min 内，用V(A)∶V(B)=90∶10 流动相洗脱;在1.0～7.0 min 内，用V(A)∶V(B)=40∶60 流动相洗脱;在7.0～7.1 min 内，用V(A)∶V(B)=20∶80流动相洗脱;在7.1～13.0 min 内，用V(A)∶V(B)=90∶10 流动相洗脱;柱温:30 ℃;进样量:5 μL．

1．2．2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测模式(MRM)，电喷雾电压(IS)4 000 V，雾化气压力(GS1)241 kPa，辅助气流速(GS2)276 kPa，气帘气压力(CUR)138 kPa，离子源温度(TEM)600 ℃，碰撞室压力(CAD)27.6 kPa，用于定量分析的离子反应分别为m/z 501.5→303.5(衍生物BC-7013)和m/z 566.0→263.0(沃尼妙林，内标)．采用内标法进行定量，以衍生物BC-7013 与沃尼妙林的色谱峰面积比对相应的药物浓度进行线性回归．

1．2．3 溶液的配制 精密称取衍生物BC-7013 10.00 mg，用甲醇溶解并用乙腈稀释配制成质量浓度为1 000 μg·mL－1标准贮备液．精密称取沃尼妙林酒石酸盐3.00 mg，用超纯水溶解并稀释成质量浓度为30 μg·mL－1的贮备液，4 ℃条件保存备用，使用时用超纯水稀释成3 μg·mL－1的内标溶液．

1．2．4 试验方案 鸡侧卧保定，分别单剂量静脉注射(2.5 mg·kg－1)与口服给药(15 mg·kg－1)衍生物BC-7013，并分离翼下静脉，安置留置针采血．翼下静脉注射后于5、10、15、30、45 min 和1、2、4、6、8、12、24、36、48 h 翼下静脉采血;由胃管直接注入嗉囊给药后于5、10、15、30、45 min 和1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h 翼下静脉采血．每次采静脉血约1.5 mL，置于肝素化的离心管中，混匀，3 000 r·min－1离心10 min，分离血浆，置－20 ℃冰箱保存．

1．2．5 鸡血浆样品的处理方法 样品室温解冻后，摇匀．准确吸取500 μL 血浆样品于2 mL 离心管中，加入3 μg·mL－1的内标沃尼妙林10 μL，旋涡振荡2 min，然后加入500 μL 乙腈，充分涡旋振荡3 min，15 000 r·min－1离心10 min，取上清液过0.22 μm 的滤头进样后，进行HPLC-MS/MS 定量分析．

1．2．6 数据处理 将血浆中实测药物质量浓度-时间数据采用WinNonlin 5.2 药动学软件进行非房室模型统计矩原理处理，计算鸡血浆的药动学参数．

2 结果与分析

2．1 色谱行为

HPLC-MS/MS 法测定衍生物BC-7013 时，样品峰及内标峰的保留时间分别为6.62 和5.41 min(图2～图5)．采用选择性离子检测方式专属性强，灵敏度高，血浆中内源性物质不干扰衍生物BC-7013 和内标的测定．

图2 鸡空白血浆样品质量色谱图Fig．2 Mass chromatogram of derivative BC-7013 in blank samples of chicken plasma

图3 鸡空白血浆添加200 ng·mL －1衍生物BC-7013 的质量色谱图Fig．3 Mass chromatogram of derivative BC-7013 in chicken plasma spiked at 200 ng·mL －1

图4 鸡静脉注射给药后30 min 血浆中衍生物BC-7013 质量色谱图Fig．4 Mass chromatogram of derivative BC-7013 in chicken plasma at 30 min after intravenous administration in chickens

图5 鸡口服给药后1 h 血浆中衍生物BC-7013 质量色谱图Fig．5 Mass chromatogram of derivative BC-7013 in chicken plasma at 1 h after oral administration in chickens

2．2 衍生物BC-7013 在鸡血浆中的标准曲线

在鸡空白血浆中精密加入不同浓度的衍生物BC-7013 标准贮备液，制备成含衍生物BC-7013 质量浓度分别为10、20、50、100、200、400、800、1 000 ng·mL－1的系列血浆样品，按“1.2.5”操作并测定，分别记录峰面积，以衍生物BC-7013 峰面积(As)对内标峰面积(Ai)的比值为纵坐标(y)，衍生物BC-7013 的质量浓度为横坐标(x)作线性回归，在10～1 000 ng·mL－1范围内线性良好．衍生物BC-7013 血浆基质匹配标准曲线的线性方程为:y=1 488.6x+1 575.4，r2=0.999 7，表明衍生物BC-7013在10～1 000 ng·mL－1范围内线性良好．衍生物BC-7013 在鸡血浆中定量限为10 ng·mL－1(S/N＞10)．

2．3 回收率和批内及批间变异系数的测定

配制含衍生物BC-7013 质量浓度为20、300、800 ng·mL－1的血样样品，各5 份，按“1.2.5”操作并测定．另配制衍生物BC-7013 质量浓度为20、300、800 ng·mL－1的乙腈溶液为对照品，加入内标，同法操作．分别在上述色谱条件下进样测定，血样样品和对照品的峰面积分别记为As和Ai，计算提取回收率［r=As/Ai×n×100%(n=1.25/1)］［6］．结果表明，低、中、高质量浓度血浆样品的提取回收率(n=5)分别为(88.39 ±2.80)%、(91.52 ±1.80)%、(89.46 ±4.76)%;同样的方法，得到内标沃尼妙林的提取回收率分别为(85.47 ±3.89)%、(86.31 ±2.45)%、(85.76 ±1.94)%．配制含衍生物BC-7013 质量浓度为20、300、800 ng·mL－1的血样质控样品，按“1.2.5”项操作并测定．于1 d 内(每个浓度平行操作5 次)测定，连续测定5 d，计算得到批内变异系数(n=5)分别为5.52%、4.87%、4.16%;批间变异系数(n=5)分别为6.82%、5.78%、5.64%．结果表明衍生物BC-7013 的平均提取回收率为(89.79 ±3.12)%，批内及批间变异系数均小于10%，符合药动学的测定要求．

2．4 药动学参数及绝对生物利用度

鸡单剂量静脉给药衍生物 BC-7013(2.5 mg·kg－1)后，测定不同时间的血药质量浓度，其药－时曲线见图6;鸡单剂量口服给药衍生物BC-7013(15 mg·kg－1)后，测定不同时间的血药质量浓度，其药－时曲线见图7;将数据采用WinNonlin 5.2 药动学软件进行非房室模型统计矩原理处理，计算出衍生物BC-7013 在鸡体内静脉和口服给药后的药动学参数，见表1．

图6 鸡静脉注射给药(2.5 mg·kg －1)后衍生物BC-7013 血药质量浓度-时间曲线Fig．6 Plasma concentration vs．time curve of derivative BC-7013 in chickens after i．v．administration(2.5 mg·kg－1)

图7 鸡口服给药(15 mg·kg －1)后衍生物BC-7013 血药质量浓度-时间曲线Fig．7 Plasma concentration vs．time curve of derivative BC-7013 in chickens after oral administration(15 mg·kg－1)

将药物动力学软件处理所得的静注和口服AUC(0→∞)值代入下式计算衍生物BC-7013 在鸡体内的绝对生物利用度(F)，F=(AUC口服/AUC静注)×(D静注/D口服)×100%．结果表明，口服衍生物BC-7013 的平均绝对生物利用度为(10.37 ±1.48)%(n=10)．

表1 鸡静注(2.5 mg·kg －1)、口服(15 mg·kg －1)衍生物BC-7013 后衍生物BC-7013 的药动学参数Tab．1 Pharmacokinetical parameters of derivative BC-7013 in chickens after a single intravenous at 2.5 mg·kg －1 and a single oral administration 15 mg·kg －1

3 讨论

3．1 静注衍生物BC-7013 的药动学特征

静脉给药结果表明，按2.5 mg·kg－1剂量给鸡静注衍生物BC-7013 后，t1/2β为(1.37 ±0.14)h，而王蕊［7］报道沃尼妙林在鸡体内的t1/2β为(2.21 ±0.30)h，表明衍生物BC-7013 在鸡体内消除比沃尼妙林更快，Vd 为(1.87 ± 0.25)L·kg－1，由于Vd 大于1 L·kg－1，表明衍生物BC-7013 在鸡体内分布广泛，可在深部组织蓄积［8］，可能广泛分布至组织间液．

3．2 口服给药衍生物BC-7013 的药动学特征

口服给药结果表明，按15 mg·kg－1剂量口服衍生物BC-7013 后，tmax为(1.94 ±0.26)h，与颜虎［9］报道的鸡口服沃尼妙林后的tmax为(1.80 ±0.68)h、Laber 等［10］报道的鸡口服泰妙菌素后的tmax为(2.14±0.27)h 相似，比Wicha 等［11］报道的人口服衍生物BC-3781 后的tmax为(1.65±0.67)h 稍大;表明衍生物BC-7013 在鸡体内的吸收速度与沃尼妙林、泰妙菌素在鸡体内的吸收速度相类似，但是比衍生物BC-3781在人体内的吸收速度要慢，可能是种属差异所致．Cmax为(126.18±6.54)ng·mL－1，比曾东平等［12］报道的猪口服沃尼妙林后Cmax为(1.35 ± 0.06)μg·mL－1、Wicha 等［11］报道的Cmax为(1.46 ±0.44)μg·mL－1小，与Laber 等［10］报道的Cmax为(3.5 ± 0.24)μg·mL－1相差较大;表明沃尼妙林在猪体内的吸收程度、泰妙菌素在鸡体内的吸收程度和衍生物BC-3781在人体内的吸收程度都比衍生物BC-7013 在鸡体内的要高．Cmax为(126.18 ±6.54)ng·mL－1，表明血药浓度较低，可能由于该衍生物存在明显的首过效应(First-pass effect)，药物经口服给药进入胃肠道第1次在肠黏膜内或经门静脉在肝脏代谢灭活后，进入血液循环的有效药量减少，从而导致AUC 和绝对生物利用度显著减小，肝肠循环使药物的吸收程度加大，而消除减慢，MRT 增大，这意味着有效血药浓度维持时间延长．

口服给药时，衍生物BC-7013 被吸收的很少，提示大部分药物都是以原型药由肠道排出，因此可以用作肠道用药．如果改变剂型，制成乳剂膏药可用于皮肤外用药．据文献报道，约40%以上的新活性物质由于水溶性差而导致生物利用度不佳［13］，生物利用度低是药理活性物质不能成为治疗药物的主要原因．所以提高药物的溶解性是开发新药的关键步骤，可以采用纳米混悬剂、微囊包被技术和固体分散技术等方法改善衍生物BC-7013 的口服给药吸收少和生物利用度低的问题．本文对衍生物BC-7013 在鸡体内的药代动力学特性进行了研究，为该药的进一步研究提供了参考．

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