马铃薯基因转化受体系统的初步研究及建立*

张西英，刘江娜，白云凤，闫建俊，张爱萍*

（1.兵团第六师农业科学研究所，新疆五家渠830000；2.山西省农业科学研究院）

马铃薯基因转化受体系统的初步研究及建立*

张西英1，刘江娜1，白云凤2，闫建俊2，张爱萍1*

（1.兵团第六师农业科学研究所，新疆五家渠830000；2.山西省农业科学研究院）

本研究以马铃薯品种大西洋和克新一号的叶片、茎段为外植体，通过农杆菌介导法，将新近发展迅速的RNA干扰技术和无标记转基因技术引入植物抗病毒基因工程。通过研究比较不同品种不同外植体的转化体系的优劣以及对再生体系的优化，研究建立一种高效的马铃薯转基因受体系统，为获得马铃薯无标记转基因植株奠定基础。结果如下：（1）茎段形成愈伤组织速度较快，且愈伤诱导率明显高于叶片诱导率，分别为82%和72%，而继代培养时叶片的愈伤分化率高于茎段，分别为81.0%和66.7%；（2）大西洋的茎段和叶片的诱导率均高于克新一号，但由试验数据可看出2个品种的马铃薯外植体的愈伤诱导率与分化率差异不大，均可作为遗传转化的受体。

马铃薯；转基因；受体系统

农杆菌作为一种天然的植物基因转化工具，其应用推动了植物分子生物学及生物技术的发展。随着对农杆菌T-DNA加工、转移及整合进植物基因组的机理的研究以及转化技术方法的提高和改进，农杆菌介导的植物基因转化的优越性将得到更充分的表现，已是植物基因工程中的常用方法，在植物基因转化中广泛应用。在众多的转基因植物中约有80%是由农杆菌介导转化完成的，是目前双子叶植物遗传转化最常用的方法，迄今获得的马铃薯转基因植株也主要是通过此途径实现的。

农杆菌介导的植物遗传转化虽然已成为当今植物遗传转化的主要途径之一，但仍需对一些问题做进一步研究。如农杆菌介导的遗传转化具有基因型依赖性，同一植物的不同基因型对农杆菌的敏感性的不同，致使转化效率存在较大的差异，主要原因是基因型不同，其细胞分化所需的激素种类、激素浓度及激素之间的配比也不同，进而影响到愈伤组织的形成及芽和根的分化。即使在转化频率比较高的植物（马铃薯、烟草、拟南芥等）中也有很大的基因型依赖性；可再生细胞部位与转化感受态细胞部位不一致，导致假转化体的出现和转化频率降低等。有研究表明，马铃薯的转化方法需要有赖于基因型进行选择，且转化效率也会因此而有所不同，甚至会有显著差异，而且根癌农杆菌对不同基因型的反应也会有显著差异[1]。这也是在某种植物基因转化过程中，没有统一标准的主要原因。

成功的基因转化首先要依赖于良好的植物受体系统的建立。所谓植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其它非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，转化选择对抗生素敏感的再生系统。而马铃薯不同外植体的愈伤诱导及分化能力存在差异，是影响基因转化率的因素之一，因此，本研究以马铃薯大西洋和克新一号的叶片、茎段为外植体，比较不同外植体的转化体系的优劣，通过对不同品种再生体系的优化，研究并建立一种高效的转基因受体系统，为下一步获得马铃薯无标记转基因植株奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新疆马铃薯主栽培品种大西洋和克新1号的无菌苗由本实验室制备。无菌苗在MS培养基上扩繁，取其叶片及茎段作为转化受体材料。实验所用菌株根癌农杆菌LBA4404和含抗马铃薯X病毒和Y病毒的RNA干扰基因的无标记基因植物表达载体由山西省农业科学院作物科学研究所转基因实验室提供。所用的基本培养基为MS培养基，包括预培养基1/4MS培养基、马铃薯诱导愈伤培养基GI（MS+6-BA2.5 mg/L+NAA0.2mg/L+Cef250mg/L）、马铃薯芽分化培养基GII（MS+ZTR2.0 mg/L+NAA0.01 mg/L+ GA30.01mg/L+Km50mg/L+Cef250mg/L）和马铃薯生根培养基（MS+IAA0.1mg/L）。其它试剂药品购自国内外相关厂家和公司。

表1 农杆菌侵染对不同品种外植体愈伤诱导及分化情况

1.2 试验方法

选择长势良好，叶片舒展，叶色良好的健壮无菌苗，将叶片沿叶基部剪下切成小块，茎段切成不带腋芽的小段，将2种外植体分别接种于1/4MS培养基上进行预培养2 d（25℃，暗光），使细胞处于“转化感受态”。之后将含有无标记表达载体的农杆菌菌液稀释到OD600为0.5，在无菌条件下，侵染经过预培养的外植体10min，侵染完成后将外植体转入不含任何抗生素的MSGI固体愈伤诱导培养基上25℃培养3 d，经过培养后，挑选出生长状态比较好的外植体，转入含Cef250mg/L的MSGII芽诱导培养基上诱导生芽。经过30～45 d的培养，将愈伤组织上分化出长至1～2 cm的小芽切下，转入生根培养基中诱导生根。将长至一定高度的幼苗取其叶片小量提取DNA并进行PCR检测，初步筛选出转化成功的植株。期间对外植体的成活率、愈伤组织诱导率、芽分化率等实验数据进行观察统计。

2 结果与分析

植物基因转化受体系统包括外植体的选择、高效再生系统的建立、抗生素敏感性试验及农杆菌的敏感性试验、建立高效的植株再生系统是进行离体选择合格基因转化体的前提。尽管马铃薯的组织培养技术已经较为成熟，但不同的基因型和不同的试验目的所要求的条件是不同的，必须针对每个试验所选择的试材品种和试验目的建立高效的植物基因转化受体系统。

本试验选择马铃薯的叶片、茎段作为遗传转化受体，而外植体的再生频率是对遗传转化效率影响的主要因素之一。因此，以大西洋和克新一号的茎段及叶片为外植体进行愈伤组织诱导及分化情况的初步试验。由表1发现2种外植体在培养条件相同时，茎段形成愈伤组织速度较快，且愈伤诱导率明显高于叶片诱导率，分别为82.0%和72.0%，而继代培养时叶片的愈伤分化率高于茎段，分别为81.0%和66.7%。茎段的愈伤化反映的过程通常是受伤茎段的两端先膨胀，愈伤组织一边膨大一边从两端逐渐向中部产生扩展，最后整个茎段形成哑铃状；叶片是从周缘被切掉的受伤部位愈伤化，其愈伤组织形成时间较晚，但愈伤组织增殖的速度较茎段快，这可能是因为叶片的受伤面积较大的原因。而叶片的褐化率、污染率均高于茎段，这可能与农杆菌侵染外植体时，叶片的接触面积大于茎段的接触面积有关。大西洋的茎段和叶片的诱导率均高于克新一号，但由试验数据可看出，2个品种的马铃薯外植体的愈伤诱导率与分化率差异不大，均可作为遗传转化的受体。

3 讨论

一般认为，基因型的特异性与细胞的生理状态存在关系，主要包括细胞受伤后的生理反应、细胞壁的结构、细胞内源激素的水平等。因此，在进行遗传转化之前，要筛选出适合转化的基因型。张鹤龄[2]等用同一种农杆菌介导转化4个马铃薯品种，结果表明，不同品种间的遗传转化效率差异很大，其中转化率最高的可达79.5%，但最低的仅为6.7%，说明马铃薯各栽培种间的遗传转化率由于受基因型的影响是不同的。以同一植物不同部位或者同一部位不同发育阶段的植物作为外植体，不同外植体对农杆菌侵染的敏感性是不同的。一般说来，对农杆菌侵染最为敏感的外植体是分生组织及伴有活跃细胞分裂的植物组织。因此，遗传转化时，选择幼叶、幼胚、茎尖顶端分生组织、小孢子愈伤组织、悬浮细胞培养物等作为外植体比较合适。农杆菌主要感染外植体的切口部位，幼嫩的外植体比老的外植体更容易被侵染，比如利用马铃薯幼嫩的块茎作为外植体进行遗传转化，能够产生较多的转化体，但有时，利用较老的植物组织作为遗传转化的受体材料，其切口细胞受到内外源激素的作用后也能转化成分生能力很强的细胞团。外植体的生理状态也会对转化效果产生影响。熊伟[3]等在以马铃薯品种PB04为材料的多次试验中发现，苗龄和植株的健壮程度也极显著地对遗传转化效率产生影响，苗龄2周左右，生长健壮的外植体具有较高的遗传转化效率和植株再生能力，当苗龄过大，如超过1个月，或者试管苗不够健壮，则会降低转化率，分化成苗率则更低。因此，植物遗传转化频率与植物的基因型具有很大的关系。

本试验中，茎段、叶片属于分化程度较高的器官，均通过脱分化诱导愈伤组织，再分化成不定芽的途径得以再生，所以再生过程耗时较长。其优点是外植体细胞经历了脱分化和再分化2个过程，具有易于接收外源基因的能力，因此转化率较高，扩繁量大，可获得较多的转化植株，但该再生系统获得的再生植株无性系周期长、变异大，转化的外源基因遗传稳定性较差。

由于植物遗传转化的频率是很低的，而在整个转基因实验的操作过程中又会经历预培养、侵染、共培养和鉴定、筛选等步骤的处理，会使再生频率受到一定影响。在实际的应用和操作过程之中，只有具有高效稳定的再生能力，才能保证在尽可能小的群体中获得实验所需要的转化个体，这也是获得一定数目转化体的基础，因此，稳定高效的受体系统的建立是转化成败的关键因素之一。建立高效的受体系统主要要考虑2个方面的因素，即适宜的外植体、适宜的培养基。理论上植物体的任何组织和器官都可以作为建立再生系统的外植体、甚至作为植物基因转化的外植体。但不同植物间，同种植物不同品种间，同一品种植物不同组织器官间，在脱分化能力、再分化能力、细胞全能性潜在趋势及感受态程度等方面都有很大差别。因此，不同种类外植体对离体培养的反应是不同的，培养效果也不同，有必要选择培养效果最好的外植体，以利于后续工作的进行。其选择原则是：（1）选择幼年型外植体；（2）增殖能力强的外植体；（3）具强再生能力基因型的外植体；（4）遗传稳定性好的外植体。

在农杆菌介导的马铃薯转基因中，转化效率一般比较低，主要受基因型、预培养、菌液浓度及侵染时间、共培养等因素的影响。马铃薯具有丰富的基因型，有研究者认为其转化方法需有赖于基因型进行选择，而且转化效率也会因此有所不同，所以各个实验室有必要根据实际情况对前人的方法进行验证和改进，以获得最适的转化条件。

[1]王春林，朱明凯，程天庆.用根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌转化马铃薯的初步研究[J].马铃薯杂志.1990，4（l）：1-7.

[2]张鹤龄.我国马铃薯抗病毒基因工程研究进展[J].中国马铃薯，2000，14（1）：25-30.

[3]熊伟，马耀华，胡碧波，等.根癌农杆菌介导的马铃薯转化系统的优化[J].广西农业生物科学，2007，26（1）：1-7.

2015—10—28

第六师五家渠科技计划项目，项目编号：1506。

*通讯作者：张爱萍（1968-），女，新疆人，研究员，研究方向为作物育种研究与推广。E-mail：379409419@qq.com。