Survivin，caspase-8在人体乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中的表达程度分析

胡一迪,胡孝渠,李权,喻明霞

(1.温州医科大学 临床系，浙江 温州，325000；2.温州医科大学附属第一医院 肿瘤外科，浙江 温州 325000；3.武汉大学 基础医学系，湖北 武汉 430072)



Survivin，caspase-8在人体乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中的表达程度分析

胡一迪1,胡孝渠2,李权2,喻明霞3

(1.温州医科大学 临床系，浙江 温州，325000；2.温州医科大学附属第一医院 肿瘤外科，浙江 温州 325000；3.武汉大学 基础医学系，湖北 武汉 430072)

目的 探讨survivin、caspase-8在人体乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中的表达程度及其意义，为乳腺相关疾病的诊断和治疗提供科学依据。方法 选取温州医科大学附属第一医院肿瘤外科手术切除病理标本人乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌病例蜡块标本，用免疫组化法(SP)检测survivin和caspase-8在各病理类型组织中表达的情况。结果 在乳腺增生乳腺癌癌前病变和乳腺癌中survivin表达的阳性率分别为(89.00±1.38)%、(89.85±1.55)%和(85.72±1.10)%)，3组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)；caspase-8在乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌表达的阳性率分别为(75.03±1.32)%、(73.59±1.08)%和(72.80±1.17)%，3组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Survivin在3种乳腺相关疾病中的表达程度由高到低依次为乳腺癌癌前病变> 乳腺增生>乳腺癌；caspase-8在3种乳腺相关疾病中的表达程度由高到低依次为乳腺增生>乳腺癌癌前病变>乳腺癌。Survivin和caspase-8的联合检测有助于对3种疾病的诊断提供参考依据。

乳腺增生；乳腺癌癌前病变；乳腺癌； survivin；caspase-8

Survivin为凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis proteins，IAP)，能够抑制细胞凋亡和调节细胞的分裂，可在常见的多种恶性肿瘤中表达，且表达与病程进展相关，比如，宫颈癌、黑色素瘤、III～IV期神经母细胞瘤以及淋巴瘤等[1-3]，但是不在成人正常组织和癌旁正常组织中表达[4]。在生理的状态下，只在成人分泌期子宫内膜、胚胎、胎盘和睾丸之中表达。

Caspase蛋白激酶为凋亡的执行、调控蛋白。与正常的细胞相比较，caspase-8在肿瘤细胞中的表达处于缺失或者抑制状态，但是此类缺失为细胞无法启动和最终凋亡的一个重要原因[5]。研究表明，在肿瘤细胞中的caspase-8并不是完全缺失，而且临床预后同表达的高低有非常密切的关系[6-7]。

最新的研究表明，并非全部caspase-8高表达的细胞自身都会发生凋亡，也非所有癌细胞内的caspase-8都有缺失。本研究对survivin和caspase-8在人体乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中的表达程度进行了分析，以期为survivin和caspase-8对肿瘤细胞具体作用机理的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 组织标本 本课题实验所选取的临床病例及标本均已取得了患者及其家人的知情同意,并签署知情同意书，且通过本医院伦理委员会的批准。收集2010年9月～2013年9月温州医科大学附属第一医院的乳腺手术标本。蜡块存档共90例，均是女性患者。取乳腺肿块，病理诊断为乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌，术前均未经放化疗及免疫治疗的标本蜡块。乳腺增生、乳腺癌和乳腺癌癌前病变均为30例。采用切片机对标本蜡块连续横断面的切片处理。每一个蜡块切取2张切片，片厚为4 μm，总共180张。

1.2 主要试剂 Caspase-8抗体、兔抗人survivin抗体(北京中山生物工程公司)；原位凋亡检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3 玻片的处理与切片 硫酸清洁液浸泡玻片5 h，用流水冲洗20 h。铬矾明胶作防脱片处理洗净烤干后的玻片。玻片经蒸馏水清洗后，于95%的乙醇中浸泡过夜。捞出95%乙醇中的玻片，置于片架上，再放入45 ℃烤箱内，烤1 h左右至干。在70 ℃的100 mL去离子水中溶解0.59 g优质明胶，冷却至室温。明胶的溶液中加入50 mg KCrSO4·12H2O，配成铬矾明胶。冰浴至4 ℃后再使用铬矾明胶。

铬矾明胶中浸泡清洁后的玻片1 min。取出玻片，置于玻片架上。放置在45 ℃的恒温箱中，过夜，玻片备用。标本都要经过连续的切片，厚度为4 μm，放于备用玻片上。为使组织紧贴于玻片，玻片放于60 ℃的烤箱中烤1 h。

1.4 SP法检测caspase-8和survivin蛋白的表达 采用SP法，按照试剂盒的说明要求进行操作。抗caspase-8抗体稀释度为1:50，兔抗人survivin抗体稀释度为1:20。DAB染色后苏木素复染，在显微镜下观察判断结果。

1.5 免疫组化结果评判标准 以背景清晰，排除非特异染色为前提。阳性结果即组织细胞核呈现明显棕黄色染色，阴性结果即无棕黄色染色。阳性的表达在高倍光镜下观察。选择40倍物镜，在高倍镜下选取5个视野。阳性表达率的计算方法如下(为避免随意性，每张切片的代表性区域选取不同视野的平均值)：阳性表达率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

2 结果

2.1 乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中survivin的阳性表达率 Survivin在不同组织中表达不同，表达程度由高到低依次为乳腺癌癌前>乳腺增生>乳腺癌，3组两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中survivin的阳性表达率±s)

△P<0.05，与乳腺增生比较，compared with breast hyperplasia；#P<0.05，与乳腺癌癌前病变比较，compared with breast precancerous lesion

图1 乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中survivin的表达Fig.1 Expression of survivin in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer

2.2 乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中caspase-8的表达 Caspase-8在不同组织中表达不同，表达程度由高到低依次为乳腺增生>乳腺癌癌前>乳腺癌，3组两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

表2 乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中caspase-8的阳性表达率±s)

△P<0.05，与乳腺增生比较，compared with breast hyperplasia；#P<0.05，与乳腺癌癌前病变比较，compared with breast precancerous lesion

图2 乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中caspase-8的表达Fig.2 Expression of caspase-8 in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer

3 讨论

本实验采用免疫组化方法对人体乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中的survivin、caspase-8的表达进行了分析，发现3者中survivin、caspase-8的阳性表达率两两之间均有统计学意义(P<0.05)。Survivin在乳腺癌中的表达程度最低，在乳腺癌癌前病变表达程度最高，在乳腺增生中表达程度较低；caspase-8在乳腺增生中的表达程度最高，在乳腺癌癌前病变中表达较低，在乳腺癌中表达程度最低。

细胞凋亡机制的紊乱和乳腺增生病、乳腺癌以及乳腺癌癌前病变3者的发生有密切的关系。细胞的凋亡受基因的调控，通过调节细胞存活期来发挥生物效应是其主要的作用机制。其中，正常组织细胞调节的重要机制即细胞凋亡。Survivin是抑凋亡基因，而caspase-8是促凋亡基因，2者是当今研究的较为重要的细胞凋亡的相关基因。有研究表明，survivin能够抑制由caspase-8诱导caspase的活化，以及阻止caspase-3同caspase-7自发活化的作用[8]。

多种凋亡基因表达产物能够影响肿瘤细胞的凋亡。积极治疗乳腺增生可延缓、阻断和逆转癌前状态，对于治疗此病本身也有利。因此，重视乳腺增生病的诊断和治疗，有着非常重要的意义。Survivin表达增高可抑制肿瘤细胞凋亡而促进其增殖，肿瘤病程的进展同survivin的表达密切相关[9]。从而，survivin可以成为检测恶性肿瘤的指标，以及作为一种肿瘤标志物。

目前，仍然没有证据表明IAP直接导致肿瘤的发生，然而，其在肿瘤发病机制过程中发挥着重要作用。与其它IAP分子不同的是，survivin蛋白只有1个N-末端的重复序列(baculoviral IAP repeat，BIR)结构，却无羧基环指的结构[- 11]。在终末分化的成人组织中检测不到survivin，其广泛表达于人类多种肿瘤组织，在人胚胎组织中高度表达并参与胚胎发育过程中的组织分化以及器官的形成。Survivin作为一种新的抗凋亡基因，具有成为检测恶性肿瘤指标的巨大潜力，survivin可以诱导肿瘤细胞的自发性凋亡，引起细胞有丝分裂失败，抑制肿瘤形成和生长[12-13]，survivin在肿瘤周围正常的组织中没有表达[14]，而在肿瘤组织中有表达。本实验免疫组化结果表明，survivin的表达的细胞胞浆中主要为阳性染色，呈黄色到深棕黄色的颗粒状。在正常乳腺组织和一般性增生的乳腺组织中，其没有着色或者仅有轻度的着色；在乳腺癌组织和不典型的增生中，可以看见大部分的癌细胞以及增生细胞中，有不同程度着色。

某些恶性肿瘤发生的关键因素是survivin的表达，可以促进细胞表型恶性转化[15-16]。乳腺增生病、乳腺癌癌前病变和乳腺癌的caspase-8表达有明显差异，表现为逐渐降低。细胞发生转化、恶变后survivin显著增加表达。乳腺癌癌前病变survivin的表达最高，在乳腺增生病、乳腺癌中分别降低。Survivin可直接作用于caspase，抑制其活性[17]。当细胞发生转化或者恶变时survivin表达显著增加，在乳腺癌组织中同样有高表达[18]，因此在乳腺病变中有重要影响。caspase-8 表达降低或基因突变与多种肿瘤的发生，发展及预后密切相关[19-20 ]。

综上所述，caspase-8和survivin的表达程度与人体乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌的发生发展密切相关。对于survivin和caspase-8的联合检测可能有助于对乳腺癌恶性程度的判断和侵袭能力进行评估，进而为乳腺癌的预后判断以及合理的治疗提供参考。

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(编校：王俨俨，吴茜)

Analysis of survivin and caspase-8 expression in human breast hyperplasia,breast precancerous lesion and breast cancer

HU Yi-di1,HU Xiao-qu2,LI Quan2,YU Ming-xia3

(1.Department of Clinic, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China; 2.Department of Surgical Oncology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000,China; 3.Department of Basic Medicine, Wuhan University, Wuhan 430072, China)

ObjectiveTo analyze the expression degree of survivin and caspase-8 in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer.MethodsThe wax block specimens of human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer cases from the first affiliated hospital of Wenzhou medical university were selected.The expression of survivin and caspase-8 in various pathological types in the organization were detected by the immunohistochemical method(SP).ResultsThe positive expression rates of survivin in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer were (89.00±1.38)%, (89.85±1.55)% and (85.72±1.10)%, respectively, the differences between every two groups were all significant (P<0.05); the positive expression rates of caspase-8 in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer were (75.03±1.32)%, (73.59±1.08)% and (72.80±1.17)%, respectively, the differences between every two groups were all significant(P<0.05). ConclusionThe expression degree of survivin in three breast-related disease from high to low was breast precancerous lesion>breast hyperplasia >breast cancer; the expression degree of caspase-8 three breast-related disease from high to low was breast hyperplasia >breast precancerous lesion>breast cancer.The combination detection of survivin and caspase - 8 expression in tumor cells provides foundation for diagnose breast-related disease.

breast hyperplasia; breast precancerous lesion; breast cancer; survivin; caspase-8

2009博士点基金(20090141120025)

胡一迪，男，本科，主治医师，研究方向：乳腺肿瘤，E-mail：hyd13957741890@163.com。

R36

A

1005-1678(2015)01-0100-03