项部针刺对动脉粥样硬化兔斑块内新生血管影响的实验研究*

万 征，王 蕾，周海纯

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨150001;3.哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨150000)

动脉粥样硬化与心脑血管事件密切相关，近年来大量研究集中在观测动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)内-中膜厚度及狭窄程度等方面。目前医学家研究发现AS 斑块的不稳定性是临床事件突发的更直接原因。所以目前医学界将确诊“不稳定动脉粥样硬化斑块”视为研究的热点［1］。随着超声造影剂的广泛使用，超声造影技术得以迅速发展，目前使用超声造影技术观察动脉粥样硬化斑块内的新生血管成为可能，而这些新生血管就是影响斑块稳定性的直接原因。因此本研究笔者采用超声造影定量分析技术及免疫组化为评价观察指标，研究项部针刺治疗对动脉粥样硬化的改善作用。

1 材料与方法

1.1 动物造模［2］

1.1.1 实验动物 选择健康雄性新西兰兔32 只(上海斯莱克责任公司，SCXK2013-0003)，体重(2.2 ±0.3 kg)。单笼高脂饮食饲养。采用数字表法随机编号。

1.1.2 饲养方式 饲料配方普通饲料占83.5%，蛋黄粉含量7.5%，混入猪油占8%以及1%胆固醇共同组成。每只动物摄入配方饲料量100 g/日，日2 次喂食，可自由加食普通饲料及饮用水。

1.1.3 入组标准 高脂喂养后3 ～4 个月后，常规超声观察兔腹主动脉，正常腹主动脉内壁光滑，AS 显示动脉管壁内-中膜增厚，局部隆起甚至多发斑块形成。见图1 ～2。

图1 超声示正常腹主动脉

图2 超声示AS 入组腹主动脉

1.2 分组治疗

采用数字表法随机编号，随机分为项针组(编号奇数)、对照组(编号偶数)，每组10 例。另外按照入组标准建立模型组试验动物10 只。对照组予阿托伐他汀(生产厂家:辉瑞制药有限公司，批准文号:国药准字H20051407)5 mg/Kg/d，水溶后灌胃，1 次/日。项针组在1 次/日阿托伐他汀5 mg/Kg/d 水溶后灌胃给药基础上，参考《实用动物针灸手册》(第2 版)选择左右风池穴、左右供血穴，电极分别接在两侧穴位上，每次30 min，应用上海医疗器械厂66805-II 电针仪，选择连续波，频率值设为5 Hz。模型组予常规饲养不予治疗。治疗30 天为时间点。

1.3 设备选择

SonoVue 超声造影剂(Braco，Italy)，配置混悬液，微泡浓度配置值2 ×108个/ml，渗透压值2900 sm/kg，微泡平均直径2.5 μm，90%的微泡直径小于8 μm;彩色超声诊断仪型号Philips iU22，聚焦深度置于腹主动脉深部，高频探头L9-3，机械指数0.07、增益90%;超声图像定量分析软件:Philips 软件产品，PC 工作站上能够脱机使用，进行数据定量分析。

1.4 检查方法

对入组动物检查，选择体积大、位置明显的AS 斑块记录，注意避免选择硬斑，对模型动物肌肉注射麻醉，选用麻醉药品为氯胺酮，浓度为10 mg/kg;安定浓度为5 mg/kg。造影剂耳缘静脉团注，注入0. 2 ml/次，后追加注射9%氯化钠液体1 ml。注射同时采集图像并存储［3］。描绘感兴趣区(ROI)，生成时间-强度曲线定量分析造影后的峰值强度与基础强度差值EI，同时计算ratio［4-5］。

1.5 免疫化学染色

对斑块内的微血管染色，采用免疫组学法，BenchmarkXT 免疫组化染色机染色，显示动脉粥样硬化斑块内血管内皮细胞中的第八因子相关F8 抗原，F8 抗原具有结合微血管上皮细胞内的抗原的特异性，细胞胞浆着色后显示棕黄色［5］，使用CMIAS2001A 型图片管理系统进行定量分析，测量阳性细胞棕黄色反应物的积分光度，分析F8 抗原的表达情况。

1.6 统计学分析

选择SPSS18.0 统计软件包进行统计分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，计量资料采用配对t检验，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 病理学改变

图3 正常组织HE 染色(×20 倍)

由图3、图4 可见，血管内皮明显增厚，可见异常斑块隆起及脂肪空泡。光镜下可见纤维组织，并且纤维组织发生断裂、溶解，平滑肌细胞中内膜明显变薄，周围存在毛细血管增生。

2.2 斑块EI 定量分析

图4 动脉粥样硬化HE 染色(×20 倍)

见表1。疗前各组比较P ＞0.05，疗后项针组与模型组比较P ＜0.01，项针组与对照组比较P ＜0.05，对照组予模型组比较P ＜0.01。

表1 斑块EI 定量分析结果(±s)

表1 斑块EI 定量分析结果(±s)

组别 例数 疗前 疗后项针组10 5.71 ±0.24 4.05 ±0.30对照组 10 5.82 ±0.22 4.40 ±0.24模型组10 5.76 ±0.24 5.30 ±0.46

2.3 斑块Ratio 定量分析

见表2。疗前各组比较P ＞0.05，疗后项针组与模型组比较P ＜0.01，项针组与对照组比较P ＜0.05，对照组与模型组比较P ＜0.01。

表2 斑块Ratio 定量分析结果

2.4 斑块内血管内皮细胞中的第八因子相关F8 抗原定量分析

见表3。疗前各组比较P ＞0.05，疗后项针组与模型组比较P ＜0.01，项针组与对照组比较P ＜0.01，对照组与模型组比较P ＜0.01。

表3 F8 抗原定量分析结果

从表1 ～表3 可见，疗前各组斑块及斑块内血管内皮细胞中的第八因子相关F8 抗原统计学分析P均＞0.05，说明各组指标疗前具有可比性。疗后1 个月观察各组斑块及斑块内血管内皮细胞中的第八因子相关F8 抗原发现，各组与疗前比较均有所改善，说明阿托伐他汀灌药及项针治疗结合阿托伐他汀灌药的治疗方法均能够抑制斑块及斑块内血管内皮细胞中的第八因子相关F8 抗原的形成，并均能够抑制斑块内新生血管形成，从而增加斑块的稳定性，避免心脑血管疾病的发生，但是两组对比分析，统计学结果证实项针治疗结合阿托伐他汀灌药的治疗方法明显优于单独阿托伐他汀灌药的治疗方法(P ＜0.05 或P ＜0.01)。因此可以证实项部电针治疗能够在一定程度上抑制动脉硬化斑块的形成，促进斑块的稳定性。

3 讨论

AS 斑块形成、发展过程中均可见斑块内新生血管，正常情况下动脉内膜依靠动脉管腔内弥散的氧供应，动脉外膜部分依靠动脉的滋养血管(vasa vasorum，VV)滋养。当动脉粥样硬化形成时，动脉的中-内膜血管增厚，由于动脉血管局部缺血诱发细胞因子释放，作为诱因，诱导形成新生血管。由于周膜细胞的缺失，导致炎性基质成分大量沉积，而沉积的炎性基质成分又阻断了腔内的弥散氧，从而AS 斑块逐渐增大，加速新生血管的形成。由于新生血管具有易破裂出血、诱发巨噬细胞浸润和斑块中央坏死等特点，因此被视为反映斑块稳定性的重要标志。近年来，临床评价AS斑块内的新生血管普遍使用的方法主要是对ROI 的时间-强度曲线进行超声造影定量分析［6］，采集量化参数表征目标属性，ROI 中各像素点的灰度均值或中值显示造影增强强度。这种分析方法起初应用于心、肝、肾等部位［7］，随着应用的发展，逐渐在斑块的CEUS 定量分析使用［8-10］。此项研究将超声造影定量分析与免疫组学检测进行对照研究。与半定量研究比较，定量分析提供的动脉粥样硬化斑块内增强的量化指标更具有客观性［11-12］，研究者同时测量斑块内的EI 及斑块内的EI 与腹主动脉管腔内的EI 的比值(ratio)，加以比较。实验结果又采用斑块内血管内皮细胞中的第八因子相关F8 抗原对动脉粥样硬化斑块内新生血管增生程度进一步反映。因此通过实验结果可以证实项部电针对动脉硬化斑块形成的抑制。

［1］ Ritman LE，Lerman A.Role of vasa vasorum in arterial disease:a reemerging factor［J］.Curr Cardiol Rev，2007，3(1):43-55

［2］ Hoogi A，Adam D，Hoffinan A，et al. Carotid plaque vulnerability:quantification of neovascularization on contrast-enhanced ultrasound with histopathologic correlation［J］.AJR Am J Roentgenol，2011，196:431-436

［3］ Sluimer JC，Daemen MJ.Novel concepts in atherogenesis:angiogenesis and hypoxia in atherosclerosis［J］.J Pathol，2009，218:7-29

［4］ Staub D，Schinkel AF，Coll B，et al. Contrast- enhanced ultrasound imaging of the vasa vasorum:from early atherosclerosis to the identification of unstable plaques［J］. JACC Cardiovasc Imaging，2010，3:761-771

［5］ 李超伦.超声造影评价动脉粥样硬化斑块新生血管形成的实验与临床研究［D］.上海:复旦大学，2011

［6］ Shalhoub J，Owen DR，Gauthier T，et al.The use of contrast enhanced ultrasound in carotid arterial disease［J］. Eur J Vasc Endovasc Surg，2010，39:381-387

［7］ Staub D，Patel MB，Tibrewala A，et al.Vasa vasorum and plaque neovascularization on contrastenhanced carotid ultrasound correlates with cardiovascular disease and past cardiovascular events［J］. Stroke，2010，41:41-47

［8］ Staub D，Partovi S，Schinkel AF，et al.Correlation of carotid artery atherosclerotic lesion echogenicity and severity at standard US with intraplaque neovascularization detected at contrast-enhanced US［J］.Radiology，2011，258:618-626

［9］ Feinstein SB，Coll B，Staub D，et al.Contrast enhanced ultrasound imaging［J］.J Nucl Cardiol，2010，17:106-115

［10］ Vicenzini E，Giannoni MF，Puccinelli F，et al.Detection of carotid adventitial vasa vasorum and plaque vascularization with ultrasound cadence contrast pulse sequencing technique and echo- contrast agent［J］.Stroke，2007，38:2841-2843

［11］ 朱英，邓又斌，刘娅妮，等. 超声造影成像技术评价颈动脉斑块内新生血管与斑块声学特性的关系［J］. 中华医学超声杂志(电子版)，2009(5):882-886

［12］ 何文.颈动脉斑块内新生血管的研究现状［J］. 中国卒中杂志，2009，4(7):585-589